工廠化栽培淺黃色金針菇雜交菌株選育初探

張根偉 谷雨泰，2 劉振國 劉昆昂 劉 萌 李書生* 董 杰

（1河北省科學(xué)院生物研究所，河北石家莊050081；2北京市第二中學(xué)，北京東城100010）

金針菇（Flammulina velutipes）又名構(gòu)菌、冬菇、毛柄金錢菌等[1]，按子實(shí)體顏色可將金針菇分為黃色金針菇和白色金針菇[2]。黃色金針菇是我國傳統(tǒng)金針菇生產(chǎn)品種，相對(duì)于白色金針菇，具有抗性強(qiáng)、產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、口感脆爽等特點(diǎn)[3]。有研究表明，黃色金針菇蛋白質(zhì)、賴氨酸等含量遠(yuǎn)高于白色金針菇，這可能是黃色金針菇風(fēng)味、口感優(yōu)于白色金針菇的原因[4]。黃色金針菇外觀深黃、基部褐色重，品相較差，子實(shí)體經(jīng)常出現(xiàn)菌柄向上彎曲、菌蓋開傘、顏色過深等現(xiàn)象，影響了其商品性。目前，黃色金針菇因其出菇不整齊、產(chǎn)量低等問題，未有工廠化生產(chǎn)。為此，筆者進(jìn)行黃色金針菇與白色金針菇雜交菌株選育，以期篩選適合工廠栽培的淺黃色金針菇品種。

1 材料與方法

1.1 供試材料

雜交親本：黃色金針菇品種“新蘇6”（XS6），為提純復(fù)壯菌株，具有高產(chǎn)、早熟、抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)；白色金針菇品種“金雜15”（Z15），為抗病性較強(qiáng)的雜交新菌株。以上菌株均為河北省科學(xué)院生物研究所提供。

病原菌：銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），河北省科學(xué)院生物研究所分離。

PDA培養(yǎng)基為馬鈴薯200 g煮汁，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0。谷粒母種培養(yǎng)料配方為谷子99 g，石膏1 g。含水量58%，pH自然。

栽培培養(yǎng)料配方為木屑30%，玉米芯20%，棉籽殼20%，麩皮15%，米糠15%。料含水量65%，pH自然。

1.2 選育方法

1.2.1 單核菌株分離篩選

分別取兩親本菇形完整、長(zhǎng)勢(shì)旺盛、接近成熟的子實(shí)體，于無菌環(huán)境下剪去菌柄，將有菌褶一面平貼在滅菌平皿上，過夜，收集孢子[5]。用無菌水稀釋孢子至2×104個(gè)/mL（血球計(jì)數(shù)板法），取50μL孢子液涂布于PDA平板中，25℃黑暗中倒置培養(yǎng)6～7 d，在平板上肉眼可見微小菌落后，用接種針挑單個(gè)菌落轉(zhuǎn)接于PDA平板上，繼續(xù)培養(yǎng)。在菌落外緣挑小菌絲塊壓水玻片于400倍顯微鏡下觀察菌絲有無鎖狀聯(lián)合，菌絲無鎖狀聯(lián)合的為所需單核菌株。在4℃條件下保存?zhèn)溆肹6]。

1.2.2 單核菌株雜交配對(duì)

選取生長(zhǎng)旺盛的兩親本單核菌株，在PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行兩兩相互配對(duì)雜交，25℃培養(yǎng)10～15 d。取菌絲刮片，400倍顯微鏡下觀察有否鎖狀聯(lián)合。將具有鎖狀聯(lián)合的雜交雙核菌株，轉(zhuǎn)入PDA試管，25℃培養(yǎng)，備用（即篩選出的供試雜交菌株，下同）。

1.2.3 雜交菌株特性考察

1.2.3.1 菌絲生長(zhǎng)速度測(cè)定

使用直徑90 mm的培養(yǎng)皿，每皿用定量蠕動(dòng)泵加入35 mL PDA培養(yǎng)基。在培養(yǎng)皿平板中心接入供試雜交菌株，25℃培養(yǎng)菌絲滿皿后，用直徑為0.5 cm的打孔器打孔制備菌餅。將菌餅接入PDA培養(yǎng)基平板中央，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。3 d后劃線，記錄菌絲生長(zhǎng)天數(shù)和測(cè)菌落半徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度。以親本為對(duì)照。

1.2.3.2 抗銅綠假單胞菌能力測(cè)定

使用直徑90 mm的培養(yǎng)皿，每皿用定量蠕動(dòng)泵加入35 mL PDA培養(yǎng)基。在培養(yǎng)皿平板中心接入供試雜交菌株，25℃培養(yǎng)滿皿后，用直徑為0.5 cm的打孔器打孔制備菌餅；同時(shí)活化銅綠假單胞菌菌種。將制備的菌餅接種到距離平板中心1.75 cm處，對(duì)稱接入銅綠假單胞菌，在25℃條件培養(yǎng)7 d。觀察記錄菌絲生長(zhǎng)及拮抗情況，測(cè)量拮抗線的寬度[7]。以親本為對(duì)照。

1.2.3.3 出菇試驗(yàn)

出菇試驗(yàn)在臨西縣天和食用菌開發(fā)有限公司[8]。將供試雜交菌株及親本菌株接入谷粒母種培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)15 d制成母種。將母種接入裝有滅菌栽培料的1100 mL規(guī)格塑料瓶中，每瓶裝濕料約750 g，每個(gè)菌株重復(fù)16瓶。前期培養(yǎng)溫度18～20℃，后期培養(yǎng)溫度12～16℃，空氣相對(duì)濕度55%～65%；待菌絲長(zhǎng)滿栽培瓶后，刮除瓶口表層菌絲進(jìn)行搔菌；搔菌后的栽培瓶移入出菇房，初始溫度17℃，維持5 d，然后逐步降低溫度，原基形成后，保持溫度8～10℃，空氣相對(duì)濕度85%～95%，CO22000 mg/kg。當(dāng)子實(shí)體高出瓶口2～3 cm時(shí)套筒，每天150 lx光照8 h，連續(xù)光照2 d，CO22000～9000 mg/kg，待菌柄長(zhǎng)至16～18 cm采收。統(tǒng)計(jì)子實(shí)體分枝數(shù)、測(cè)產(chǎn)量，觀察記錄子實(shí)體顏色。

1.2.4 菌株的ITS鑒定

采用真菌ITS序列通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和 ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）對(duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：2.5 μL 10×PCR Buffer、2 μL dNTP、引物分別加入0.5μL、0.5μL Taq DNA 聚合酶、0.5μL DNA模板，用水補(bǔ)至25μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃2 min，94℃ 40 s，52℃ 1 min，72℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán)，72℃5 min，將PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)[9]。采用PCR純化試劑盒EP101（北京全式金生物科技有限公司）對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。采用試劑盒CT301（北京全式金生物科技有限公司）將純化后的PCR產(chǎn)物連接T3載體，挑陽性克隆接種于液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h，驗(yàn)證陽性克隆，將陽性克隆菌液送至華大基因進(jìn)行測(cè)序，所得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行比對(duì)，采用MEGA 6軟件，通過臨近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel2007處理數(shù)據(jù)，獲得均值及標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS2.0軟件中Duncan檢驗(yàn)方法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交結(jié)果

從黃色金針菇“新蘇6”中分離鑒定出單孢菌株15個(gè)，白色金針菇“金雜15”中分離鑒定出單孢菌株5個(gè)。進(jìn)行兩兩相互配對(duì)雜交，共配對(duì)雜交組合75個(gè)，以鎖狀聯(lián)合為標(biāo)記鑒定雜交菌株，確定雜交菌株37個(gè)，雜交成功率為49.3%。

2.2 雜交菌株特性

對(duì)37個(gè)雜交菌株菌絲生長(zhǎng)速度測(cè)定和抗病原銅綠假單胞菌能力測(cè)定，其中生長(zhǎng)速度顯著高于親本的雜交菌株有13個(gè)，詳見表1。由表1可知，病原銅綠假單胞菌可以強(qiáng)烈抑制金針菇菌絲的生長(zhǎng)，拮抗帶越窄金針菇抗性越強(qiáng)（圖1）。菌絲生長(zhǎng)速度快的13個(gè)菌株，抗病原銅綠假單胞菌能力均強(qiáng)于親本，排在前5位的分別為F9、F2、F14、F6和F1。

表1 親本與雜交菌株菌絲長(zhǎng)速及抗菌能力

2.3 出菇試驗(yàn)結(jié)果

13個(gè)雜交菌株工廠化栽培出菇試驗(yàn)結(jié)果見表2。由于生理“吐水”嚴(yán)重，出菇過程中采取了3次倒水操作，F(xiàn)6和F12由于“吐水”過多，未能正常出菇。由表2可知，雜交菌株子實(shí)體均為黃色，其中8個(gè)菌株子實(shí)體顏色較黃色親本“新蘇6”顏色淺。產(chǎn)量處前3名的雜交菌株為F1、F17和F9，分別為296 g/瓶、278 g/瓶和271 g/瓶，分別比親本“新蘇6”提高39.6%、31.1%和27.8%。從吐水量和產(chǎn)量關(guān)系看（圖3、表2），除F8以外，吐水量和產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)。

圖1 親本和4個(gè)雜交菌株與病原銅綠假單胞菌拮抗情況

圖2 雜交菌株子實(shí)體

表2 雜交菌株出菇情況

2.4 菌株ITS真實(shí)性分析

圖3 金針菇產(chǎn)量和“吐水”量比較

ITS序列是真菌基因組rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，位于18S和5.8S rDNA以及5.8S和28S rDNA之間，在物種屬內(nèi)、近緣屬間乃至科內(nèi)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系研究中有一定的價(jià)值。采用ITS1和ITS4引物序列對(duì)篩選出的金針菇雜交菌株及親本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小為823～844 bp的片段（圖4）。選擇Lentinula edodesL9作為外圍，如圖5所示，F(xiàn)1與F17親緣關(guān)系最近，F(xiàn)9與F1、F17、F33親緣關(guān)系次之，選育出的金針菇F1、F17、F9菌株與親本Z15和XS6并未聚集在一類，為不同于親本的新菌株。

圖4 金針菇雜交菌株及親本的ITS電泳

圖5 基于ITS序列構(gòu)建的金針菇的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 小結(jié)與討論

出菇試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃色金針菇和白色金針菇在菌絲生長(zhǎng)階段的差異主要為：黃色金針菇在栽培料中菌絲生長(zhǎng)粗壯，生長(zhǎng)快，搔菌后至原基形成階段易出現(xiàn)生理“吐水”現(xiàn)象。工廠化立瓶栽培金針菇，出現(xiàn)“吐水”過多，會(huì)把剛形成的原基淹沒，導(dǎo)致原基缺氧死亡。因此，筆者認(rèn)為嚴(yán)重的生理“吐水”現(xiàn)象是黃色金針菇工廠化栽培不成功原因之一。

試驗(yàn)選育出的大多數(shù)雜交菌株子實(shí)體顏色比黃色親本淺（圖2），抗病原銅綠假單胞菌能力、產(chǎn)量介于兩個(gè)親本之間，同時(shí)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)量與“吐水”量大體呈負(fù)相關(guān)；篩選出的F1、F17及F9雜交菌株子實(shí)體顏色淺黃，抗性強(qiáng)，“吐水”少，產(chǎn)量高于黃色金針菇親本。試驗(yàn)為進(jìn)一步雜交選育適宜工廠化栽培產(chǎn)量高、品質(zhì)好黃色金針菇奠定了基礎(chǔ)。