一株黃山野生雙孢蘑菇菌株菌絲體培養(yǎng)特性研究

沈萬芳

（黃山風(fēng)景區(qū)管委會園林局，安徽黃山245800）

黃山位于安徽省南部黃山市境內(nèi)，是我國著名的山岳型風(fēng)景名勝區(qū)，其獨特的地貌景觀在國內(nèi)乃至世界上都具有典型性和獨特的美學(xué)價值[1]。黃山屬亞熱帶季風(fēng)氣候，全年雨水豐沛，云霧天多，由于自然環(huán)境優(yōu)越，森林覆蓋率達84.7%，植被覆蓋率達93%，因此黃山境內(nèi)動植物資源特別豐富[2]。大部分中低海拔林中陰暗潮濕，大量枯枝落葉分解后為大型真菌生長提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)。因此，大型真菌資源極為豐富[2]。

蘑菇又名雙孢蘑菇、白蘑菇、洋蘑菇等，廣泛分布于世界各處，在森林落葉地帶最為豐富[3]。雙孢蘑菇人工栽培始于法國路易十四時代，隨后在歐洲和北美各地迅速推廣，20世紀(jì)20年代中期傳入中國[4]。雙孢蘑菇作為21世紀(jì)栽培最廣、產(chǎn)量最多的主栽食用菌，不僅味道鮮美，口感獨特，而且肉質(zhì)肥厚，具有極高的食用價值和藥用價值[5]。但因為其遺傳基礎(chǔ)比較狹窄，長期栽培會造成菌株適應(yīng)能力降低，加速菌株的退化[6]。筆者于2017年在黃山山林中采集到雙孢蘑菇菌株，經(jīng)分離鑒定為野生雙孢蘑菇，標(biāo)本存放于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)森林保護實驗室?，F(xiàn)將對野生雙孢蘑菇菌絲體培養(yǎng)特性研究總結(jié)如下，以期為該菌株馴化選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

①野生雙孢蘑菇子實體于2017年7月采集自黃山國家森林公園，采集地為海拔五百多米的攬勝橋附近竹林地，地被為落葉腐殖質(zhì)。子實體由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)森林保護實驗室分離、保存，標(biāo)號為HS20170701。②碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：瓊脂粉2%，蛋白胨0.2%，硫酸鎂0.05%，磷酸氫二鉀0.1%。待測碳源：葡萄糖2%，麥芽糖2%，果糖2%，乳糖2%，蔗糖2%，可溶性淀粉2%。③氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)液：葡萄糖2%，瓊脂粉2%，硫酸鎂0.05%，磷酸氫二鉀0.1%。待測氮源：蛋白胨2%，硝酸銨2%，硫酸銨2%，硝酸鈉2%，牛肉膏2%，尿素2%。④最適溫度培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%。⑤pH試驗培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基，用鹽酸和氫氧化鈉將培養(yǎng)基的pH分別調(diào)到4、5、6、7、8和9作為供試培養(yǎng)基。

1.2 試驗方法

1.2.1 碳源試驗

將6種待測碳源用精密天平各稱取3 g，分別加入碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，以不加碳源為對照，每組做5個重復(fù)。將培養(yǎng)液與培養(yǎng)皿滅菌后，在接種臺上酒精燈環(huán)境下，將培養(yǎng)液倒入每個培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液厚度5 mm。待其冷卻凝固后在培養(yǎng)皿中心部位接入菌絲塊（5 mm2）。

1.2.2 氮源試驗

將6種待測氮源各稱取3 g，分別加入氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，以不加氮源為對照。其余操作方法同碳源試驗。

1.2.3 培養(yǎng)溫度試驗

采用上述方法配制PDA培養(yǎng)基，與培養(yǎng)皿一同高溫滅菌后在接種臺中將培養(yǎng)液平均倒入30個培養(yǎng)皿中，待其冷凝后在培養(yǎng)皿中間接入菌絲塊（5 mm2），分別放在18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃的恒溫箱中培養(yǎng)。每組做5個重復(fù)。

1.2.4 pH試驗

采用上述方法配制PDA培養(yǎng)基，用HCl、NaOH將其pH分別調(diào)為4、5、6、7、8、9。與培養(yǎng)皿一同高溫滅菌后在接種臺上將培養(yǎng)液平均倒入30個培養(yǎng)皿中，待其冷卻凝固后在培養(yǎng)皿中心部位接入菌絲塊（5 mm2）。每組5個重復(fù)。

1.2.5 菌落測量

測量菌落的直徑時過中心點沿垂直兩個方向測量，接種2 d后再開始測量，每天記錄菌落直徑，直到菌絲鋪滿整個培養(yǎng)皿為止。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

計算菌絲的平均每天生長速度，利用Excel表格對各項數(shù)據(jù)進行處理分析[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲體生長最適碳源

采用DPSV7.05進行Duncan新復(fù)極差法單因素方差分析，可知不同碳源對供試野生雙孢菌株菌絲生長速度的影響達到顯著差異（P=0.0466＜0.05），以碳源為可溶性淀粉時，生長速度最快，為14.54 mm∕d，并且菌絲長勢最好；當(dāng)碳源為葡萄糖、果糖、麥芽糖時的菌絲生長速度分別為11.27 mm∕d、10.85 mm∕d和9.54 mm∕d，菌絲長勢也比較好，但都沒有可溶性淀粉為碳源時生長勢好；碳源為乳糖時菌絲生長速度較慢，為6.44 mm∕d。對照組生長速度最慢，為4.56 mm∕d，而且菌絲長勢較差。

對不同碳源的菌絲生長速度進行多重比較表明：葡萄糖、麥芽糖、果糖和蔗糖對菌絲生長速度的影響無顯著差異，與乳糖、可溶性淀粉之間差異顯著；乳糖與對照之間無顯著差異，與可溶性淀粉之間差異顯著；菌絲生長速度均比對照快。說明碳源能夠促進雙孢蘑菇菌絲體的生長，適宜碳源：可溶性淀粉、葡萄糖、果糖（表1）。

表1 供試碳源培養(yǎng)基上野生雙孢蘑菇菌絲生長比較

2.2 菌絲體生長最適氮源

由表2可以看出，在不同的氮源培養(yǎng)上供試野生雙孢蘑菇菌絲生長速度及生長勢均有所不同，當(dāng)?shù)礊榈鞍纂藭r，菌絲生長速度最快，為36.76 mm∕d，菌絲長勢也很好；當(dāng)?shù)礊榕Ｈ飧鄷r菌絲生長速度為30.42 mm∕d，菌絲長勢不及蛋白胨；而氮源為硫酸銨和硝酸鈉時，菌絲生長速度很慢，分別為10.56 mm∕d和12.84 mm∕d，生長勢更不及蛋白胨；氮源為硝酸銨時，菌絲生長速度慢而且長勢也差；氮源為尿素及對照組，菌絲幾乎不生長，這說明雙孢蘑菇的菌絲生長離不開氮源營養(yǎng)，并且尿素不能對雙孢蘑菇菌絲生長有較好的影響。

不同氮源對菌絲生長速度的影響達到極顯著差異水平（P=0.0028＜0.01），多重比較表明：氮源為蛋白胨、牛肉膏時兩者菌絲生長速度的差異不顯著，但與其他處理之間差異極顯著；氮源為硫酸銨、硝酸銨與氮源為硝酸鈉時菌絲生長速度有差異，但未達到顯著水平，生長速度中等；氮源為尿素時及對照組菌絲生長速度最慢，兩者差異不顯著。由此可見，在6組氮源中，只有蛋白胨和牛肉膏才是雙孢蘑菇菌絲生長所需的、較為適宜的氮源。

表2 供試氮源培養(yǎng)基上野生雙孢蘑菇菌絲生長比較

2.3 菌絲生長最適溫度

由表3可見，在不同培養(yǎng)溫度，供試雙孢蘑菇菌株菌絲生長有不同。菌絲在18～20℃生長較緩慢，長勢差；在22～24℃，菌絲生長速度很快，并且長勢好；在26～28℃，菌絲生長速度最快。

表3 不同培養(yǎng)溫度供試野生雙孢蘑菇菌絲生長比較

不同培養(yǎng)溫度的菌絲生長速度單因素方差分析表明，各處理間差異極顯著（P=0.0001＜0.01），多重比較表明：在溫度18℃與20℃菌絲生長速度差異不顯著，菌絲生長速度較慢；22℃、24℃、26℃與28℃菌絲生長速度差異顯著，菌絲生長速度較快。但培養(yǎng)溫度24℃菌絲平均每天增長量最大，由此得出，供試雙孢蘑菇最適宜菌絲生長溫度為24℃左右。

2.4 菌絲生長最適pH

由表4可見，在pH為4～9的培養(yǎng)基上，菌絲均能生長，但菌絲長勢長速卻大不相同。pH6時，菌絲生長速度最快，達3.77 mm∕d，且長勢好；pH5時，菌絲生長速度較pH為6時慢，但仍快于其他pH處理；pH4、7、8、9時菌絲生長很慢而且長勢較差。

單因素方差分析可知各處理間差異極顯著（P=0.0001＜0.01），多重比較表明：pH4與pH5時菌絲生長速度差異不顯著，pH4時生長速度最慢；pH6、7、8、9時菌絲生長速度差異顯著。pH6時菌絲生長速度最快，為最適宜菌絲生長的培養(yǎng)基pH。

表4 不同pH的培養(yǎng)基上供試雙孢蘑菇菌絲生長比較

3 小結(jié)與討論

雙孢蘑菇菌絲體對葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉均可以利用，對葡萄糖、果糖和可溶性淀粉利用的較充分，即葡萄糖、果糖和可溶性淀粉是雙孢蘑菇菌絲體生長的適宜碳源。氮源是食用菌生長發(fā)育過程中最重要的營養(yǎng)來源之一[8]。試驗結(jié)果可知，不同的氮源，野生雙孢蘑菇菌絲的生長情況有所不同，在氮源為硝酸鈉、硝酸銨、硫酸銨、尿素的培養(yǎng)基中的菌絲長勢遠不如氮源為蛋白胨和牛肉膏。在對照組（無氮源）培養(yǎng)基中的菌絲生長情況最差，說明氮源是雙孢蘑菇菌絲的生長不可或缺的營養(yǎng)源。

雙孢蘑菇菌絲生長不僅需要滿足其營養(yǎng)需求，還要維持適宜的生長條件，溫度對菌絲的生長也有著較大的影響[9]。試驗結(jié)果可知，供試野生雙孢蘑菇菌株菌絲適宜生長溫度為24℃左右，超過或低于該溫度都會影響菌絲生長。菌絲生長環(huán)境的pH對菌絲生長有著重要的影響，供試野生雙孢蘑菇菌株菌絲雖然在pH4～9都能生長，但生長情況卻大不相同，pH6，菌絲生長綜合最優(yōu)。