多學(xué)科交叉的藥用植物組織培養(yǎng)課程理論教學(xué)

邢世海，柳鶯鶯，曹夢陽，蘇興隆，吳家文，彭代銀*

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院 中藥資源保護(hù)與開發(fā)研究所，安徽 合肥 230012；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 人文與國際教育交流學(xué)院，安徽 合肥 230012)

植物是能合成初生和次生代謝產(chǎn)物的生物工廠[1-2]，藥用植物大多具有豐富的次生代謝成分[3]，某些藥用植物還能合成特異代謝產(chǎn)物，從而產(chǎn)生巨大的藥用價值，如黃花蒿特異地合成青蒿素[4]，紅豆杉樹皮特異合成紫杉醇[5]，長春花地上部分合成長春堿和長春新堿等[6]。然而，不少藥用植物難以育出種子、種子易休眠或缺少胚乳[7-9]等導(dǎo)致種子的有性繁殖方式存在障礙，而通過無性繁殖方式育苗，特別是組織培養(yǎng)技術(shù)培育藥用植物具有一定的優(yōu)越性。

《藥用植物組織培養(yǎng)》是一門以現(xiàn)代生命科學(xué)知識為基礎(chǔ)，結(jié)合化學(xué)學(xué)科的相關(guān)科學(xué)原理，采用先進(jìn)的生物技術(shù)手段，以藥用植物為研究對象，進(jìn)行組織與器官的發(fā)生、培養(yǎng)和細(xì)胞融合、遺傳轉(zhuǎn)化及生產(chǎn)次生代謝物和中藥材工廠化育苗的一門綜合的、新興的、交叉的應(yīng)用學(xué)科[10]。藥用植物組織培養(yǎng)在藥用植物種苗培育上的重要性，使該課程成為中藥學(xué)、中藥資源開發(fā)利用專業(yè)本科生的一門應(yīng)用型專業(yè)課。

藥用植物組織培養(yǎng)的多學(xué)科交叉性，要求該課程教學(xué)過程中需結(jié)合多學(xué)科知識教學(xué)，指導(dǎo)學(xué)生掌握以下內(nèi)容：①藥用植物本身的內(nèi)在生理特征，生長與發(fā)育規(guī)律，形態(tài)特征與解剖結(jié)構(gòu)；②藥用植物室外栽培的基本原理與基本技術(shù)、栽植管理與病蟲害防治方法，外界環(huán)境對藥用植物生長發(fā)育的影響等知識；③植物次生代謝物生物合成相關(guān)的植物化學(xué)知識；④植物分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)相關(guān)知識；⑤種子、種苗學(xué)的繁殖技術(shù)，苗圃的規(guī)劃、設(shè)計相關(guān)知識；⑥生物統(tǒng)計學(xué)、實(shí)驗(yàn)設(shè)計相關(guān)原理知識。鑒此，為深化藥用植物組織培養(yǎng)多學(xué)科交叉教學(xué)理論研究，促進(jìn)高校藥用植物組織培養(yǎng)多交叉學(xué)科的實(shí)踐展開，本文從教學(xué)角度對藥用植物組織培養(yǎng)的相關(guān)學(xué)科交叉教學(xué)內(nèi)容進(jìn)行探討。

1 藥用植物組織培養(yǎng)教學(xué)與植物生理學(xué)內(nèi)容緊密結(jié)合

植物生長需要合適的營養(yǎng)條件、適宜的水分條件和偏酸性的環(huán)境，這些在植物生理學(xué)上稱為礦質(zhì)營養(yǎng)[11]，藥用植物所需營養(yǎng)成分根據(jù)濃度大小分為大量元素和微量元素，室外生長的植物營養(yǎng)成分和水分可由根系從土壤中獲得，植物缺少了某些成分會出現(xiàn)獨(dú)特的營養(yǎng)缺素癥現(xiàn)象[12]，藥用植物組織培養(yǎng)時，由于外植體離體培養(yǎng)，所有這些成分必須來自于培養(yǎng)基，培養(yǎng)基組成和配制的教學(xué)中結(jié)合植物生理學(xué)的礦質(zhì)營養(yǎng)相關(guān)內(nèi)容利于學(xué)生理解并把握基本培養(yǎng)基特別是MS培養(yǎng)基的成分組成和濃度水平。

植物能合成生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、乙烯、脫落酸、油菜素內(nèi)酯、獨(dú)腳金內(nèi)酯等植物激素[11,13-16]，植物激素對植物的生長發(fā)育起著重要的調(diào)控作用，而離體植物材料即組培的外植體含有極其微量的內(nèi)源激素且不能再生，組培時需加入外源激素或合成的類似結(jié)構(gòu)且有相近活性的生長調(diào)節(jié)劑，來調(diào)控外植體的定向誘導(dǎo)。我校中藥學(xué)專業(yè)本科課程設(shè)置中未開設(shè)植物生理課程，植物激素和生長調(diào)節(jié)劑又是植物組培定向誘導(dǎo)的指揮棒，所以將植物激素相關(guān)內(nèi)容融入到藥用植物組織培養(yǎng)的教學(xué)中顯得尤為重要；生長素與細(xì)胞分裂素的比例在誘導(dǎo)外植體成芽還是成根時起決定性的調(diào)控作用，掌握這一規(guī)律在實(shí)際組織培養(yǎng)中可以通過調(diào)節(jié)比例控制外植體向芽或向根誘導(dǎo)的定向分化；2,4-D在誘導(dǎo)植物愈傷組織中起極其重要的作用[17]，把握這個知識點(diǎn)，在誘導(dǎo)愈傷組織時加入合適濃度的2,4-D能更好地誘導(dǎo)出愈傷組織；在植物激素和植物生長調(diào)節(jié)劑中，同一類成分的不同種類對外植體的誘導(dǎo)作用的強(qiáng)弱不同，作用的時間周期也不同，這些植物生理學(xué)相關(guān)知識利于學(xué)生根據(jù)實(shí)際需要選擇合適的植物激素或生長調(diào)節(jié)劑及其濃度水平。

環(huán)境因素對生物生長發(fā)育具有一定的影響作用，這在植物生理學(xué)中稱之為植物生長生理[11]，對植物生長機(jī)理的理解能全面地考慮各種因素對藥用組織培養(yǎng)植物材料的影響，在實(shí)際組織培養(yǎng)中對于溫度、水分、氧氣和光照等外在環(huán)境條件的設(shè)置會更為科學(xué)、合理；植物具有不同光周期，這部分內(nèi)容能指導(dǎo)在組培中根據(jù)不同植物及其不同的生長、發(fā)育時期設(shè)置不同的光、暗周期。

可見，無論是培養(yǎng)基的成分、激素篩選及配比、外植體的定向誘導(dǎo)、培養(yǎng)條件的控制等方面都需要植物生理學(xué)相關(guān)知識，所以在這部分的教學(xué)中將植物生理學(xué)知識與組織培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，能起到更好的教學(xué)效果，保證教學(xué)質(zhì)量。

2 結(jié)合植物栽培學(xué)知識的藥用植物組織培養(yǎng)教學(xué)

在工廠化育苗生產(chǎn)中，藥用植物試管苗需要從溫室移栽到大田中，這個過程中植物生存的環(huán)境發(fā)生很大的變化，需要對試管苗進(jìn)行馴化移栽，室內(nèi)的試管苗移植到室外成為大田中生長的種苗需要一個漸進(jìn)的適應(yīng)過程。藥用植物栽培學(xué)較為系統(tǒng)地介紹了植物生長發(fā)育與環(huán)境條件之間的關(guān)系，其中包括環(huán)境條件及其本身的互作、溫度和光照對植物生長發(fā)育的影響、植物的生長發(fā)育與水分的關(guān)系、土壤及其微生物與植物生長發(fā)育之間的關(guān)系、植物之間的關(guān)系等[18]。了解并掌握這些知識，在藥用植物組培苗馴化移栽中，采取正確的處理措施，將藥用植物組培苗科學(xué)合理地進(jìn)行大田種植；也能更好地區(qū)別異地引種馴化與藥用植物組培苗的馴化移栽過程，了解并掌握它們之間的異同點(diǎn)。

3 藥用植物組織培養(yǎng)教學(xué)與藥用植物學(xué)知識相結(jié)合

藥用植物組織培養(yǎng)是建立在植物細(xì)胞全能性學(xué)說的基礎(chǔ)之上，以藥用植物為對象，在離體條件下利用人工培養(yǎng)基對植物的器官、組織、細(xì)胞、原生質(zhì)體等進(jìn)行無菌培養(yǎng)，使之再生細(xì)胞或長成完整植株的一門技術(shù)[10]。因此，在選擇外植體時對植物的組織類型、器官種類需充分地熟悉與了解[19]，對它們的生長及生理狀態(tài)能很好地把握，方能選出組織培養(yǎng)的適宜外植體；理論上任何組織、器官，無論處于什么狀態(tài)都可以作為外植體進(jìn)行培養(yǎng)，但實(shí)際上很多組織、器官一旦達(dá)到或超過稱之為過渡態(tài)的生長發(fā)育時期就很難再脫分化，進(jìn)而再分化了。在細(xì)胞培養(yǎng)中要對植物細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)、細(xì)胞壁的組成充分了解，便于學(xué)習(xí)機(jī)械法和酶法獲得細(xì)胞的內(nèi)容，分離單細(xì)胞時的酶處理過程將會更加熟練。在藥用植物組織培養(yǎng)教學(xué)的各論中，包括胚乳、子房和胚珠培養(yǎng)；花粉和花藥培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)和莖尖脫毒等內(nèi)容，學(xué)生需要掌握植物花粉與花藥的形成相關(guān)知識，掌握子房、胚珠和胚乳的發(fā)育過程等基礎(chǔ)理論，才能更好地在植物活體上切割外植體，更好地理解胚乳培養(yǎng)為何可以獲得三倍體和花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株。

4 藥用植物組織培養(yǎng)教學(xué)需結(jié)合分子生物學(xué)和基因工程相關(guān)知識

藥用植物組織培養(yǎng)與藥用植物的基因工程、遺傳轉(zhuǎn)化密切關(guān)聯(lián)，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方式大多必須借助于組織培養(yǎng)技術(shù)，特別是侵染了攜帶目的基因載體農(nóng)桿菌的細(xì)胞培養(yǎng)和愈傷組織誘導(dǎo)，誘導(dǎo)的愈傷組織再生植株，這些環(huán)節(jié)都需要借助組織培養(yǎng)技術(shù)。同時分子生物學(xué)和基因工程的知識也能讓學(xué)生更好地理解植物組織培養(yǎng)：①不同部位的外植體具有不同的再生能力，可以從基因表達(dá)的時空、組織特異性[20]讓學(xué)生了解雖然同一植物體上的基因組是完全一致的，但因?yàn)檗D(zhuǎn)錄及其調(diào)控的時空和組織特異性導(dǎo)致它們的生長發(fā)育時期和生理狀態(tài)存在差異，在這部分還可以把分子生物學(xué)的啟動子知識，特別是組織特異性啟動子[21]介紹給學(xué)生。②植物激素的調(diào)控作用，將激素受體及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及其級聯(lián)放大反應(yīng)等相關(guān)知識傳授給學(xué)生，同時植物激素本身或其級聯(lián)放大產(chǎn)生的信號可能會作為順式作用元件，這些順式作用元件通過與相應(yīng)啟動子的結(jié)合或分離，從而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，達(dá)到激素刺激植物生長發(fā)育的目的，這些知識點(diǎn)有助于學(xué)生更好地理解植物激素和植物生長調(diào)節(jié)劑在組織培養(yǎng)中具有強(qiáng)大的定向誘導(dǎo)功能。③在講解植物傳粉受精過程中的生殖隔離時，花粉與柱頭相互識別的識別蛋白知識利于學(xué)生理解。④在藥用植物的細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化的教學(xué)過程中將植物基因克隆、載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化后經(jīng)組織培養(yǎng)再生植株以及這些植物材料的分子檢測相關(guān)基因工程技術(shù)穿插到教學(xué)中，既擴(kuò)大了學(xué)生的知識面，激起學(xué)習(xí)興趣，也能讓學(xué)生更好地掌握植物細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化的內(nèi)容。⑤在原生質(zhì)體培養(yǎng)、細(xì)胞融合等獲得體細(xì)胞雜種時，對體細(xì)胞雜種的鑒定，將分子鑒定引進(jìn)來，既豐富了教學(xué)內(nèi)容，又讓學(xué)生掌握了相關(guān)的研究方法。

5 與植物化學(xué)相關(guān)知識相結(jié)合

藥用植物含大量的次生代謝物，主要包括：萜類、酚類和生物堿等化合物[3]。這些代謝物在生物體內(nèi)的合成機(jī)制與調(diào)控方式既涉及植物生理學(xué)知識也涉及分子生物學(xué)基因的轉(zhuǎn)錄與蛋白的合成調(diào)控機(jī)制[22]，同時涉及植物化學(xué)知識。藥用植物次生代謝物可以通過植物組織培養(yǎng)方式來生產(chǎn)，特別是珍稀瀕危且具有高藥用價值的特異性代謝產(chǎn)物，如采用天然植物材料，利用植物化學(xué)方法提取純化代謝物，材料來源非常有限。此時，可以利用組培產(chǎn)生的愈傷組織、大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)的細(xì)胞作為材料，提取次生代謝成分，既克服了材料來源的問題又可保護(hù)這些瀕危藥用植物資源不被破壞。因此，在藥用植物組織培養(yǎng)關(guān)于次生代謝物生產(chǎn)部分的教學(xué)中，將植物化學(xué)相關(guān)知識，特別是提取、純化知識與工藝向?qū)W生做相應(yīng)的介紹與補(bǔ)充尤為重要。植物組織培養(yǎng)形成的愈傷組織和再生植株的次生代謝物組成與含量往往與天然的中藥植物體本身體內(nèi)成分往往也存在一定的差異[23]。

6 藥用植物組織培養(yǎng)教學(xué)需結(jié)合種子種苗學(xué)

藥用植物組織培養(yǎng)一個重要的應(yīng)用就是通過叢生芽再生的方式快速繁殖苗木[10]。愈傷組織經(jīng)由胚狀體或器官發(fā)生再生叢生芽，再將叢生芽分植誘導(dǎo)生根，最后形成再生芽和根之間由維管束相連的植株，從而獲得組培苗，叢生芽誘導(dǎo)率直接影響著快繁的速度[10]。藥用植物組織培養(yǎng)誘導(dǎo)的胚狀體可作為人工種子的胚，再加入營養(yǎng)成分、附加成分，包被上人工種皮如海藻酸鈉等材料，就可制作成人工種子[24]。藥用植物的組培苗或人工種子的種植利用，需有種子種苗相關(guān)的知識背景，所以將苗圃規(guī)劃設(shè)計、種子種苗的繁育[25]等相關(guān)知識穿插到組織培養(yǎng)快速繁殖和人工種子相應(yīng)章節(jié)會產(chǎn)生更好的教學(xué)效果，便于未來從事藥用苗圃建設(shè)相關(guān)工作的同學(xué)有一個良好的知識背景。

7 藥用植物組織培養(yǎng)教學(xué)需結(jié)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計與生物統(tǒng)計學(xué)

藥用植物組織培養(yǎng)是實(shí)踐很強(qiáng)的一門學(xué)科[10]，在植物培養(yǎng)過程中，需從不同的外植體種類，消毒試劑的種類、濃度和消毒時間，基本培養(yǎng)基種類，激素種類和濃度及不同激素組合等方面考慮；還需考慮培養(yǎng)方式，包括：通過愈傷組織再生器官(芽或根)或胚狀體然后形成植株，還是器官發(fā)生方式等方面，綜合考慮這些因素才能篩選出最佳培養(yǎng)方案。這需要學(xué)生有實(shí)驗(yàn)設(shè)計和生物統(tǒng)計方面的相關(guān)知識，掌握大樣本和小樣本的量、全實(shí)施或部分實(shí)施實(shí)驗(yàn)等知識，才能合理設(shè)計實(shí)驗(yàn)和實(shí)施科學(xué)的樣本量，得出令人信服的結(jié)果。如實(shí)驗(yàn)中需考慮上述的多因素，不同因素設(shè)置多個水平，這類實(shí)驗(yàn)如果采用全實(shí)施方式，工作量極其巨大，如采用部分實(shí)施的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計[26]，可大大減少工作量和節(jié)省實(shí)際開支。為此，需將正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計的實(shí)驗(yàn)設(shè)計思路、如何設(shè)計、怎樣選擇正交表相關(guān)知識講解清楚，同時將正交實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析方法與該部分教學(xué)內(nèi)容相結(jié)合講解；還需考慮各因素間是否存在交互作用，若存在交互作用需選擇交互作用的正交表來安排實(shí)驗(yàn)，此時需根據(jù)交互作用的自由度安排實(shí)驗(yàn)列，從而應(yīng)用與無交互作用不同的正交表，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的安排不一樣[27]。由于正交實(shí)驗(yàn)可以適當(dāng)節(jié)省工作量，在應(yīng)用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計篩選最佳培養(yǎng)方案時，可將各方面因素全面考慮進(jìn)來。使用正交實(shí)驗(yàn)全面研究各因素對藥用植物組織培養(yǎng)的影響，既可促進(jìn)學(xué)生更好地理解植物生長所需要的營養(yǎng)條件和形態(tài)建成的激素條件，也利于學(xué)生以后進(jìn)行植物組織培養(yǎng)研究時能更好地設(shè)計實(shí)驗(yàn)和分析數(shù)據(jù)。

在教學(xué)過程中，以“正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計及其數(shù)據(jù)分析在藥用植物的組織培養(yǎng)中的應(yīng)用”為專題，進(jìn)行一個正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計的實(shí)例來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)安排設(shè)計和結(jié)果的統(tǒng)計分析專題教學(xué)，將藥用植物組織培養(yǎng)的最佳外植體、最佳激素組合、最佳篩選方法，不同階段包括啟動培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和生芽培養(yǎng)等要求的最佳配方中的影響因子作為因素，設(shè)置水平，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)篩選。通過專題教學(xué)，以組織培養(yǎng)作為論文課題的畢業(yè)設(shè)計的學(xué)生能更好地安排實(shí)驗(yàn)。其實(shí)，植物組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基如MS、WPM、N5、B6等，對于不同的培養(yǎng)材料、培養(yǎng)階段有時需對大量元素、微量元素和有機(jī)成分等的含量和組成進(jìn)行微調(diào)，以獲得具體外植體材料具體培養(yǎng)方式的最佳基本培養(yǎng)基，優(yōu)化過程可采用正交實(shí)驗(yàn)來完成。

綜上所述，在藥用植物組織培養(yǎng)教學(xué)中采用多學(xué)科內(nèi)容相結(jié)合教學(xué)，使學(xué)生既掌握了組織培養(yǎng)的基本原理和基本技術(shù)，也能更深層次、更好地理解與把握這門技術(shù)及其應(yīng)用。同時，藥用植物組織培養(yǎng)在工廠化育苗、人工種子培育、大規(guī)模細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物時還需要考慮成本預(yù)算，也需要了解經(jīng)濟(jì)學(xué)相關(guān)知識。所以在藥用植物組織培養(yǎng)相關(guān)章節(jié)教學(xué)過程中與學(xué)生互動，根據(jù)學(xué)生的背景知識復(fù)習(xí)或全面講解相關(guān)學(xué)生欠缺的知識點(diǎn)，能起到更好的效果。