CCR3的缺失導(dǎo)致阿爾茨海默病小鼠模型中β-淀粉樣蛋白和過(guò)度磷酸化tau蛋白的減少

隋 軼 張 堯 徐 冰 *

（沈陽(yáng)市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬沈陽(yáng)腦科醫(yī)院、沈陽(yáng)市腦病研究所），遼寧 沈陽(yáng) 110041）

阿爾茨海默病（AD）是一種以進(jìn)行性記憶障礙為突出表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變疾病，占所有癡呆的60%～70%。AD的主要病理標(biāo)志包括由星形膠質(zhì)細(xì)胞和微膠質(zhì)細(xì)胞包圍的細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白（Aβ）沉積共同構(gòu)成的老年斑，以及由過(guò)度磷酸化的tau組成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，由活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的趨化因子似乎在AD的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[1]。不同的趨化因子可能在AD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮不同的作用。CCL11是可能參與AD病理學(xué)的一種重要趨化因子。CCL11在衰老過(guò)程中已被證明在血清中逐漸升高，其年齡依賴性增加與海馬依賴性學(xué)習(xí)和記憶任務(wù)的缺陷相關(guān)。CCL11與一種由星形膠質(zhì)細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元表達(dá)的趨化因子受體，CCR3結(jié)合[2]。在本研究中，我們擬應(yīng)用APP/PS1/CCR3-/-三重突變小鼠證實(shí)CCR3介導(dǎo)了AD病理中的β-淀粉樣蛋白和過(guò)度磷酸化tau蛋白的產(chǎn)生。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物：為獲得CCR3基因缺陷小鼠（APP/PS1/CCR3-/-），將雜合的APP/PS1小鼠連續(xù)與CCR3-/-小鼠雜交，隨后進(jìn)行交叉。

1.2 免疫組化：處死的小鼠大腦固定在含有4%多聚甲醛和15%甘油的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）細(xì)胞保護(hù)劑中。在冷凍切片機(jī)上切割切片（50 μm），在PBS中充分洗滌并作為自由漂浮的切片處理。通過(guò)將切片，在含有0.5%Triton X-100和3%牛血清白蛋白的PBS中，在室溫下溫育1 h來(lái)實(shí)現(xiàn)滲透和阻斷。漂洗后與相應(yīng)抗體共浴。

1.3 體視學(xué)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析：應(yīng)用熒光或光學(xué)顯微鏡進(jìn)行體視學(xué)分析，油浸100×物鏡。使用如前所述的無(wú)偏立體細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)的光學(xué)分離器方法計(jì)數(shù)海馬中Aβ斑，星形膠質(zhì)細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞和p-Tau陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量。

1.4 蛋白質(zhì)印跡分析：將細(xì)胞或腦組織在含有蛋白酶抑制劑混合物的TBS（20 mL Tris-HCl緩沖液，pH 7.4，150 mL NaCl）中勻漿，包括0.5 mL苯甲基磺酰氟，20 μg/mL抑肽酶，20 μg/mL亮抑酶肽，20 μg/mL胃蛋白酶抑制劑和1 mL EDTA。將勻漿物短暫超聲處理并以15000×g離心30 min。在還原條件下，將樣品（每泳道10 μg蛋白質(zhì)）在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。用含有0.1% Tween 20，3%干乳的TBS封閉膜1 h，然后在室溫下用特異性抗體孵育2 h。洗滌后，將印跡與相應(yīng)的HRP標(biāo)記的第二抗體一起溫育1 h。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析：用SPSS18.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。分析是使用雙因素方差分析進(jìn)行，然后進(jìn)行Fisher最不顯著差異事后分析，以確定顯著的效果。P＜0.05被認(rèn)為達(dá)到顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 CCR3缺陷減少了APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠中的Aβ的產(chǎn)生和沉積以及相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞增生和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生：為檢查在AD小鼠模型中CCR3對(duì)Aβ產(chǎn)生和沉積的影響，我們將CCR3-/-小鼠與APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠雜交以產(chǎn)生APP/PS1/CCR3-/-三重突變小鼠及其同窩小鼠。我們比較了這些動(dòng)物（12個(gè)月大）的大腦中的Aβ沉積和相關(guān)膠質(zhì)增生。應(yīng)用Aβ42抗體的免疫組織化學(xué)和體視學(xué)分析表明，Aβ沉積物在WT和CCR3-/-小鼠中無(wú)法被檢測(cè)出，然而其在APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因和APP/PS1/CCR3-/-三重突變體小鼠的皮質(zhì)和的海馬中卻可以被檢出。同時(shí)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)Aβ沉積顯著高于APP/PS1/CCR3-/-三重突變小鼠。我們還觀察到，在APP/PS1/CCR3-/-三重突變體小鼠和APP/PS1同窩小鼠中，絕大多數(shù)的Aβ形式是～40聚體，～20聚體，四聚體和三聚體，以及中等的單體水平。有趣的是，與APP/PS1同窩相比，在APP/PS1/CCR3-/-三重突變小鼠的Aβ三聚體，四聚體，和40～聚物顯著減少。在這個(gè)AD小鼠模型中，Aβ沉積物被活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞包圍，即星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生，它們被認(rèn)為是神經(jīng)炎癥的主要來(lái)源。有趣的是，與APP/PS1同窩小鼠相比，在APP/PS1/CCR3-/-三重突變小鼠中觀察到了明顯減少的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和小膠質(zhì)細(xì)胞增生。

2.2 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠中的CCR3缺陷降低tau過(guò)度磷酸化：與野生型同窩小鼠相比，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬組織中包括T181、T205、S199和S235在內(nèi)的多個(gè)部位的tau蛋白過(guò)度磷酸化顯著增加。有趣的是，與APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠相比，APP/PS1/CCR3-/-三重突變小鼠表現(xiàn)出tau的過(guò)度磷酸化顯著降低。使用抗p-tau抗體（T181）的免疫組織化學(xué)和體視學(xué)分析，我們證實(shí)APP/PS1/CCR3-/-三重突變小鼠海馬中p-tau陽(yáng)性神經(jīng)元明顯少于APP/PS1同窩小鼠。

3 討 論

在本研究中，我們證明了，在APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠中，CCL11受體CCR3的缺乏顯著降低了Aβ的產(chǎn)生以及相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞增生和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，tau蛋白過(guò)度磷酸化。因此，趨化因子受體CCR3介導(dǎo)了AD的重要病理變化的發(fā)生。

在AD患者的大腦中，tau異常過(guò)度磷酸化，并且在這種改變的狀態(tài)下，它聚集成成對(duì)的螺旋狀細(xì)絲，形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)。此外，新皮質(zhì)中神經(jīng)纖維纏結(jié)的密度與癡呆相關(guān)[3]。因此，開發(fā)合理的基于tau的治療藥物需要識(shí)別tau異常過(guò)度磷酸化的觸發(fā)因素并理解其內(nèi)在機(jī)制。趨化因子似乎是涉及tau病理學(xué)的重要因素。現(xiàn)在，我們提供證據(jù)證明CCL11/CCR3在tau蛋白過(guò)度磷酸化中發(fā)揮作用。除了tau蛋白病理外，由Aβ沉積物和周圍活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞組成的老年斑是AD的另一個(gè)重要標(biāo)志。Aβ沉積被認(rèn)為是小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的主要觸發(fā)因素，這二者都有助于神經(jīng)炎癥的發(fā)展。在APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的腦中，我們觀察到CCR3缺乏顯著降低Aβ的水平，主要是它的低聚物形式。最后，我們觀察到CCR3缺陷顯著降低小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，表明對(duì)CCL11/CCR3的早期干預(yù)可能減少AD患者腦中的神經(jīng)炎癥。