Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)毛囊干細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控作用

夏肖雪 綜述 呂正梅，張守兵 審校

毛囊干細(xì)胞(hair follicle stem cells，HFSCs)是一群位于毛囊隆突部的成體干細(xì)胞，具有一般干細(xì)胞的基本特性，即自我更新能力和多潛能性[1]。與胚胎干細(xì)胞的持續(xù)增殖和分化不同，它在大部分時(shí)間里處于靜息狀態(tài)，只在毛囊生長(zhǎng)期早期被激活。它不僅維持正常皮膚中毛囊的再生，在皮膚損傷時(shí)移植毛囊干細(xì)胞還能重建毛囊、表皮和皮脂腺[2]。毛囊干細(xì)胞的增殖和分化受到嚴(yán)格調(diào)控，Wnt/β-catenin信號(hào)通路是其中重要的調(diào)控通路之一。

1 毛囊干細(xì)胞在毛囊發(fā)生和毛囊周期中的作用

目前普遍認(rèn)為，在胚胎期毛囊的發(fā)育過(guò)程中，表皮成分與真皮成分間一系列復(fù)雜的相互作用誘導(dǎo)毛囊的形態(tài)學(xué)發(fā)生：首先，真皮細(xì)胞發(fā)出信號(hào)，誘導(dǎo)表皮基底細(xì)胞增厚形成毛基板；之后，毛基板細(xì)胞釋放趨化因子，誘導(dǎo)間充質(zhì)成纖維細(xì)胞增生、聚集形成真皮聚集體，毛基板細(xì)胞增殖，形成毛芽，真皮聚集體最終發(fā)育成真皮乳頭；真皮乳頭細(xì)胞釋放信號(hào)，刺激毛囊干細(xì)胞增生，形成毛釘，并分化成毛囊中的各種細(xì)胞，形成完整毛囊及毛干[3](圖1)。

圖1 毛囊發(fā)生示意圖

毛發(fā)的生長(zhǎng)不是連續(xù)的，而是呈現(xiàn)周期性，稱(chēng)為毛囊周期，包括生長(zhǎng)期、退行期、靜止期。在生長(zhǎng)期末期，有絲分裂活動(dòng)減緩并最終停止，繼而凋亡活動(dòng)加劇，毛囊進(jìn)入退行期，最終剩余的細(xì)胞在隆突部下方形成毛芽，真皮乳頭位于毛芽下方；在靜止期，毛囊干細(xì)胞處于靜息狀態(tài)；之后，毛芽和隆突部中的干細(xì)胞在真皮乳頭傳遞的信號(hào)刺激下被激活、增殖，毛囊進(jìn)入下一個(gè)生長(zhǎng)期，新形成的毛母質(zhì)細(xì)胞包裹真皮乳頭，不斷增殖和分化，形成新的完整毛囊并產(chǎn)生毛干[4](圖2)。

圖2 毛囊周期示意圖

Wnt/β-catenin信號(hào)通路廣泛存在于多細(xì)胞真核生物中，高度保守。它在誘導(dǎo)毛囊形態(tài)發(fā)生、維持毛囊生長(zhǎng)發(fā)育、干細(xì)胞聚集、遷移以及分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在毛囊的周期性生長(zhǎng)中，真皮乳頭被認(rèn)為是調(diào)節(jié)毛囊形態(tài)發(fā)生和毛發(fā)生長(zhǎng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中心，可通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路誘導(dǎo)毛囊干細(xì)胞的增殖和分化。若Wnt失調(diào)，不僅會(huì)出現(xiàn)增殖和分化的失衡，還會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[5]。

2 Wnt/β-catenin信號(hào)通路

Wnt蛋白是一類(lèi)富含半胱氨酸的分泌性糖蛋白，可通過(guò)旁分泌或自分泌發(fā)揮作用，與細(xì)胞膜上的七次跨膜卷曲蛋白(Frizzled)受體家族及低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LDL receptor related protein，LRP)結(jié)合，穩(wěn)定并積累胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin[6]。哺乳動(dòng)物的基因組編碼十七種Wnt蛋白，在皮膚中表達(dá)的有Wnt3、Wnt4、Wnt5a、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11和 Wnt16[7]。

β-catenin蛋白是Wnt信號(hào)通路的重要分子之一，參與胚胎形成及個(gè)體發(fā)育等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程。在沒(méi)有Wnt時(shí)，細(xì)胞中的β-catenin與α-catenin及鈣黏素E(E-cadherin)形成復(fù)合物，參與細(xì)胞間以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏合連接；而胞質(zhì)中游離的β-catenin被核心蛋白軸蛋白(axis inhibition，Axin)、腺瘤樣結(jié)腸息肉病蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)、酪蛋白激酶-1α(casein kinase 1 alpha，CK1α)和糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase 3 beta，GSK3β)組成的復(fù)合體磷酸化，E3泛素連接酶β-TrCP(β transducinrepeats-containing proteins，β-TrCP)識(shí)別磷酸化的β-catenin，通過(guò)蛋白酶體途徑將其降解，轉(zhuǎn)錄因子LEF/TCF(lymphoid enhancer factor/T-cell factor)與轉(zhuǎn)錄抑制因子TLE(transducin-like enhancer)結(jié)合，使染色體處于非活化狀態(tài)(圖3A)。而當(dāng)Wnt結(jié)合到Frizzled和LRP5/6時(shí)，激活胞質(zhì)蛋白Dvl(Dishevelled)，導(dǎo)致LRP5/6被CK1α和GSK3β磷酸化，Axin與LRP5/6結(jié)合，胞質(zhì)中游離的β-catenin不被磷酸化而積累下來(lái)。β-catenin入核，取代TLE而與轉(zhuǎn)錄因子LEF/TCF結(jié)合，招募兩種組蛋白修飾因子CREB結(jié)合蛋白(CREB-binding protein，CBP)和Brg1以及輔激活因子如Bcl9和Pygo(Pygopus)，激活靶基因的表達(dá)(圖3B)[6, 8]。

3 Wnt/β-catenin信號(hào)通路在毛囊發(fā)生和毛囊干細(xì)胞增殖中的作用

3.1Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活誘導(dǎo)毛囊的發(fā)生在胚胎期毛囊發(fā)育過(guò)程中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活是毛基板形成的一個(gè)關(guān)鍵起始步驟[9]。分別在小鼠表皮角質(zhì)細(xì)胞或真皮成纖維細(xì)胞中特異性地將Wnt分泌相關(guān)基因Evi/Wls(Wntless)敲除后發(fā)現(xiàn)，表皮來(lái)源的Wnt配體對(duì)真皮上部Wnt信號(hào)通路的激活是至關(guān)重要的，而后者的激活最終導(dǎo)致毛基板的形成[9-10]。這些研究表明，Wnt介導(dǎo)的信號(hào)首先出現(xiàn)在表皮內(nèi)，其后才發(fā)生表皮和真皮間的復(fù)雜相互作用及形成毛囊。此外，過(guò)表達(dá)Wnt細(xì)胞外抑制劑DKK1 (Dkk-1)的轉(zhuǎn)基因小鼠能阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而影響毛囊的發(fā)生和發(fā)育，甚至最終導(dǎo)致出生后小鼠毛囊的缺失[11]。在胚胎發(fā)生期，條件性敲除表皮中的β-catenin基因?qū)е旅宓男纬墒茏?，從而阻斷了毛囊的形態(tài)發(fā)生[12]。此外，毛基板形成后，在從毛芽到毛釘發(fā)育過(guò)程中，毛釘上部區(qū)域中的Wnt/β-catenin信號(hào)減弱，是毛囊干細(xì)胞形成的前提條件，因?yàn)閃nt/β-catenin信號(hào)抑制SOX9，而后者是毛囊干細(xì)胞形成所必需的[13]。

圖3 Wnt/β-catenin信號(hào)通路

3.2Wnt信號(hào)調(diào)控毛囊干細(xì)胞的增殖毛囊形成后，在哺乳動(dòng)物的一生中處于生長(zhǎng)期、退行期和靜止期的周期性循環(huán)中(圖2)。毛囊周期中，毛囊干細(xì)胞的靜息和激活受到微環(huán)境細(xì)胞來(lái)源的骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)信號(hào)和Wnt信號(hào)的嚴(yán)格調(diào)控。在靜止期，真皮成纖維細(xì)胞表達(dá)BMP4，皮下脂肪細(xì)胞表達(dá)BMP2，隆突部?jī)?nèi)層角蛋白K6+細(xì)胞分泌高水平的BMP6和FGF18。上述BMP蛋白和FGF18均抑制毛囊干細(xì)胞的增殖而將其維持在靜息狀態(tài)。靜止期末期，BMP表達(dá)降低，使毛囊干細(xì)胞較易于激活[5]。真皮乳頭通過(guò)分泌BMP抑制因子Noggin將毛囊干細(xì)胞中的BMP信號(hào)關(guān)閉，轉(zhuǎn)換為Wnt/β-catenin信號(hào)，從而激活毛囊干細(xì)胞增殖，毛囊進(jìn)入生長(zhǎng)期。實(shí)際上，從靜止期早期到晚期，真皮乳頭中毛芽激活因子如FGF-7、FGF-10和 TGF-β2 以及BMP抑制因子Noggin的水平是逐漸升高的[14]。如果去除真皮乳頭，靜止期毛囊不能進(jìn)入生長(zhǎng)期，說(shuō)明真皮乳頭對(duì)于毛囊干細(xì)胞的激活來(lái)說(shuō)是必需的[14]。在表達(dá)的Wnt蛋白中，Wnt7b可能在激活Wnt/β-catenin通路中起重要作用，該蛋白在出生后第一個(gè)生長(zhǎng)期啟動(dòng)時(shí)(出生后第21天)表達(dá)，但在靜止期不表達(dá)，若出生后敲除Wnt7b，毛囊干細(xì)胞的激活被遲滯[15]。然而，雖然關(guān)于毛囊從靜止期進(jìn)入生長(zhǎng)期調(diào)控機(jī)制的研究很多，但最早的激活機(jī)制是什么，或者說(shuō)，上述信號(hào)通路又是被如何調(diào)控的，目前還不得而知。

Wnt、β-catenin和下游的LEF/TCF都在毛囊的再生中發(fā)揮重要作用。2013年，Choi et al[16]通過(guò)分別在整個(gè)表皮中、毛囊干細(xì)胞中和在毛囊間表皮中敲除β-catenin并與異位表達(dá)DKK1的結(jié)果相比較發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)毛囊干細(xì)胞的增殖來(lái)說(shuō)是必需的，但毛囊干細(xì)胞的維持不需要β-catenin存在于毛囊干細(xì)胞中。Lei et al[17]的結(jié)果證明，小鼠觸須Wnt10b蛋白的過(guò)表達(dá)可激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，促進(jìn)毛母質(zhì)細(xì)胞的增殖，從而誘導(dǎo)毛囊進(jìn)入生長(zhǎng)期；腺病毒介導(dǎo)的Wnt10b蛋白過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)毛囊由靜止期進(jìn)入生長(zhǎng)期。相反，siRNA介導(dǎo)的Wnt10b基因敲除可阻止毛囊進(jìn)入生長(zhǎng)期[18]。Wnt10b介導(dǎo)的Wnt通路異常激活會(huì)使處于增殖狀態(tài)CD34+毛囊干細(xì)胞的數(shù)量增加，導(dǎo)致毛球、毛干和真皮乳頭都變大[19]。這些結(jié)果都表明，Wnt10b可通過(guò)激活Wnt信號(hào)通路促進(jìn)毛囊干細(xì)胞增殖。

在成年小鼠的表皮中短暫表達(dá)β-catenin，正常的毛囊周期被打斷而進(jìn)入生長(zhǎng)期，并從頭形成新的毛囊[20]，表明依賴(lài)β-catenin的Wnt通路足以誘發(fā)毛囊干細(xì)胞的增殖及后繼新毛囊的生長(zhǎng)。而在成體毛囊的真皮乳頭中敲除β-catenin基因，毛囊不能進(jìn)入生長(zhǎng)期[21]，說(shuō)明真皮乳頭中的β-catenin對(duì)毛囊干細(xì)胞的增殖也具有調(diào)控作用。在體外培養(yǎng)條件下，β-catenin敲除的毛囊干細(xì)胞能夠自我更新和長(zhǎng)期傳代；但是在體內(nèi)，毛囊干細(xì)胞高表達(dá)TCF3/4，在沒(méi)有β-catenin激活的情況下，長(zhǎng)時(shí)間處于靜息狀態(tài)而不增殖。進(jìn)一步研究表明，對(duì)毛囊干細(xì)胞增殖的激活來(lái)說(shuō)，β-catenin并不是必需的，如果TCF3/4的水平有效降低，不需要β-catenin即可激活增殖[22]。也就是說(shuō)，TCF3/4的水平下降或是Wnt/β-catenin的水平上升，都會(huì)打破毛囊干細(xì)胞的靜息狀態(tài)，使毛囊進(jìn)入生長(zhǎng)期。

Garza et al[23]發(fā)現(xiàn)，雄激素性禿頂男性的頭皮中，K15+α6-整合素+的毛囊干細(xì)胞仍然存在，但前體細(xì)胞包括CD200+α6-整合素+和CD34+細(xì)胞均顯著減少，可能是導(dǎo)致毛囊體積變小、毛干短小的原因。這說(shuō)明在禿頂頭皮中，毛囊干細(xì)胞的激活存在障礙，但是否是由于Wnt信號(hào)通路失調(diào)導(dǎo)致的，目前尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究。

關(guān)于靜止期隆突部毛囊干細(xì)胞中的Wnt/β-catenin信號(hào)通路，很多結(jié)果傾向于認(rèn)為其處于被抑制的狀態(tài)，例如Wnt抑制因子SFRP1、Dkk3和WIF1在毛囊干細(xì)胞和真皮乳頭中高表達(dá)，而Wnt蛋白Wnt3和Wnt3a表達(dá)下調(diào)3倍以上[5]。Dasgupta et al[24]和Lien et al[22]分別發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的報(bào)告基因TOPGAL和Axin2-LacZ在靜止期毛囊干細(xì)胞中處于失活狀態(tài)，這與靜止期隆突部毛囊干細(xì)胞核中無(wú)β-catenin是一致的。然而，2016年，Lim et al[25]發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)靜止期，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵分子之一Axin2在處于靜息狀態(tài)的隆突部外根鞘毛囊干細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，當(dāng)β-catenin被條件性敲除時(shí)，Axin2的表達(dá)缺失。因此，靜止期毛囊干細(xì)胞中Axin2的表達(dá)依賴(lài)于β-catenin的存在，許多其他Wnt靶基因如Lgr5也是如此，這表明Wnt/β-catenin信號(hào)在靜止期毛囊干細(xì)胞中可能是處于活化狀態(tài)的。深入研究發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)靜止期中，Wnt1、Wnt4和Wnt7b在隆突部都表達(dá)，在外根鞘細(xì)胞中表達(dá)最高，Wnt5a不表達(dá)，而Wnt3、Wnt6、Wnt10a和Wnt10b雖然表達(dá)，但處于較低水平，這表明靜止期隆突部毛囊干細(xì)胞本身即為Wnt信號(hào)的來(lái)源[25]。在從靜止期向生長(zhǎng)期過(guò)渡時(shí)，Axin2、Wnt1、Wnt4和Wnt7b在隆突部持續(xù)表達(dá)，而Wnt6、Wnt7b、Wnt10a和Wnt10b在毛芽和真皮乳頭交界處的細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，后者表明某些Wnt蛋白可能參與表皮成分與真皮成分間的相互作用，以激活毛芽中的干細(xì)胞，啟動(dòng)生長(zhǎng)期[25]。

另外，很多觀點(diǎn)認(rèn)為，毛囊一旦進(jìn)入生長(zhǎng)期后，毛囊干細(xì)胞中的Wnt信號(hào)即處于被抑制狀態(tài)，以減少其增殖次數(shù)，維持其“干性”。然而Lim et al[25]發(fā)現(xiàn)，Wnt4、Wnt7b和Axin2在生長(zhǎng)期毛囊的隆突部中持續(xù)表達(dá)，這表明在生長(zhǎng)期，毛囊干細(xì)胞中的Wnt信號(hào)并沒(méi)有被抑制，Wnt/β-catenin信號(hào)處于活化狀態(tài)，然而其功能有待深入研究。

Wnt/β-catenin信號(hào)也可以通過(guò)下游轉(zhuǎn)錄因子實(shí)現(xiàn)其調(diào)控功能。最近，Telerman et al[26]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄抑制因子Blimp1是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游靶蛋白之一，在胚胎第12.5天敲除真皮成纖維細(xì)胞中的Blimp1會(huì)遲滯毛囊發(fā)生，阻止創(chuàng)傷后新毛囊的形成，在表皮中過(guò)表達(dá)β-catenin能消除因Blimp1敲除而導(dǎo)致的表型。

4 Wnt/β-catenin信號(hào)通路在毛囊干細(xì)胞分化中的作用

Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)毛囊干細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，并根據(jù)不同的細(xì)胞信號(hào)向相應(yīng)的細(xì)胞譜系方向進(jìn)行分化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高表達(dá)β-catenin誘導(dǎo)毛囊干細(xì)胞向毛囊的構(gòu)成細(xì)胞方向分化；β-catenin低表達(dá)或缺乏時(shí)，毛囊干細(xì)胞不再參與毛發(fā)的自我更新，而是向著上皮角質(zhì)細(xì)胞的方向分化[27]。Dasgupta et al[24]在出現(xiàn)上述現(xiàn)象后，再次使β-catenin過(guò)表達(dá)，上述過(guò)程發(fā)生翻轉(zhuǎn)，即本來(lái)分化成上皮方向的細(xì)胞向形成毛囊結(jié)構(gòu)的方向分化，使毛發(fā)的生長(zhǎng)可以繼續(xù)進(jìn)行。另外，有研究[28]顯示，提高穩(wěn)定的β-catenin的含量，可誘導(dǎo)成年表皮新毛囊的形成。Lien et al[22]的研究也發(fā)現(xiàn)，在沒(méi)有Wnt 信號(hào)時(shí)，TCF3/4和TLE結(jié)合到普通染色體區(qū)域，該區(qū)域含一些被抑制基因，這些基因在發(fā)生毛囊干細(xì)胞命運(yùn)決定時(shí)必須被經(jīng)典Wnt 信號(hào)抑制。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的其他關(guān)鍵蛋白也在毛囊干細(xì)胞分化調(diào)控中發(fā)揮作用。在Wnt處于激活狀態(tài)時(shí)，LEF-1最初表達(dá)于毛芽處的干細(xì)胞中，其后在短暫增殖的毛母質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行定向分化并形成毛干時(shí)，在該群細(xì)胞中處于較高表達(dá)水平[22]。LEF-1敲除的小鼠出生后致死，其毛囊短小，發(fā)育停滯在胚胎第17天的水平，出生后不能產(chǎn)生觸須和體毛，其毛囊中雖然能夠分化形成黑色素細(xì)胞，但其功能異常，不能產(chǎn)生黑色素。相反，在隆突部和毛囊間表皮中過(guò)表達(dá)LEF-1，導(dǎo)致在表皮內(nèi)形成毛芽樣結(jié)構(gòu)[29]。Wnt分泌相關(guān)基因Evi/Wls也被發(fā)現(xiàn)在毛囊干細(xì)胞中表達(dá)，在胚胎毛囊發(fā)育時(shí)將其敲除會(huì)導(dǎo)致毛發(fā)稀少，表皮增厚[25]。

5 展望

關(guān)于Wnt/β-catenin信號(hào)通路在毛囊干細(xì)胞增殖中的調(diào)控作用已經(jīng)有了較多研究；然而，雖然毛囊干細(xì)胞子代細(xì)胞的定向分化在新毛囊的形成中至關(guān)重要，但該方面的研究極其匱乏。另外，β-catenin和DNA結(jié)合蛋白LEF/TCF是如何識(shí)別和調(diào)控其靶基因的，仍知之甚少。LEF/TCF蛋白在不同細(xì)胞和組織中對(duì)染色體的修飾不同，提示它們的靶基因和輔因子依賴(lài)于細(xì)胞類(lèi)型及所處環(huán)境。在皮膚受到損傷時(shí)，表皮中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)處新毛囊的產(chǎn)生，然而近期的研究[30]顯示，成年小鼠真皮成纖維細(xì)胞中β-catenin的上調(diào)抑制新毛囊的發(fā)生，具體原因有待進(jìn)一步分析。

用毛囊干細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚，可用于臨床治療脫發(fā)患者的毛發(fā)再生、燒傷、燙傷與皮膚缺損患者的創(chuàng)面修復(fù)等。但是，早期的研究[2]證明，毛囊干細(xì)胞具有強(qiáng)大的增殖能力，在進(jìn)行臨床移植時(shí)，其增殖和分化行為必須受到精確調(diào)控。深入研究毛囊干細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控機(jī)制，可極大促進(jìn)對(duì)毛囊干細(xì)胞生物學(xué)特性的了解和認(rèn)識(shí)，為其應(yīng)用于臨床提供理論基礎(chǔ)。