胚胎植入前遺傳學篩查在復發(fā)性流產(chǎn)及高齡患者中的應用

韓慧敏，舒明明，揣云海，陳夢楠，郝鎂娟,商 微，封志純

胚胎植入前遺傳學篩查(preimplantation genetic screening, PGS)也稱胚胎植入前非整倍性篩查即對行體外受精(invitrofertilization, IVF)發(fā)育到第 3天或第 5天的胚胎進行染色體非整倍性篩查，選擇整倍性染色體胚胎移植，以提高臨床妊娠率(clinical pregnancy rate，CPR),降低早期流產(chǎn)率。育齡婦女初次妊娠的自然流產(chǎn)率約為5%～13%，而2次自然流產(chǎn)后再次流產(chǎn)的發(fā)生率約為24%～29%[1]。美國生殖醫(yī)學學會(ASRM)[2]和美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學會(ACOG)[3]將復發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion,RSA)定義為2次或者2次以上的妊娠丟失。RSA的病因復雜，包括遺傳學因素、解剖學因素、內分泌因素、感染因素、免疫功能異常、抗磷脂綜合征及獲得性血栓前狀態(tài)等，其中大部分RSA的發(fā)生都與胚胎的非整倍體狀態(tài)相關，有研究[4]顯示RSA中胚胎非整倍體率超過50%。該文通過分析行PGS的高齡和RSA患者染色體的異常發(fā)生率及其臨床結局，一是提高上述兩種情況的活產(chǎn)率；二是為PGS技術的進一步推廣提供臨床數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器G1、G2培養(yǎng)基購自瑞典Vitrolife公司；Covaris S2系統(tǒng)超聲購自美國Covaris公司；Qiagen純化試劑盒購自德國Qiagen公司；DNA建庫試劑盒購自美國New England Biolabs公司；HiSeq2500系統(tǒng)購自美國Illumina公司。

圖1 單細胞染色體高通量測序檢測流程

1.2研究對象和方法

1.2.1病例資料 回顧性分析2014年12月～2017年3月在中國人民解放軍海軍總醫(yī)院生殖醫(yī)學中心行PGS 91例患者125個周期的臨床資料，患者年齡25～45(34.06±5.20)歲，體質指數(shù)(21.34±3.0)kg/m2，基礎促卵泡生成素(7.95±4.1)mIU/ml。其中RSA患者54例，均有2次或2次以上的自然流產(chǎn)史；高齡患者47例(>35歲)，最大年齡為45歲；其中高齡的RSA患者10例。所有患者行PGS前簽署知情同意書。

1.2.2胚胎培養(yǎng)、活檢 MII(Metaphase II)期卵母細胞采用單精子胞漿內注射(intracytoplasmic sperm injection ,ICSI)方式進行體外受精，G1培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)， 48 h后卵裂胚轉移至G2培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h。對卵裂期或囊胚期的胚胎進行活檢。一般活檢單個卵裂球細胞或4～8個囊胚滋養(yǎng)層細胞，活檢后的胚胎行玻璃化冷凍，液氮中長期保存。

1.2.3全基因組擴增及測序 所有活檢標本的單細胞全基因組擴增均采用多次退火環(huán)狀循環(huán)擴增技術(multiple annealing and looping-basedamplification cycle, MALBAC)。首先，擴增是通過將DNA退火到一個隨機引物庫中，與由27個通用核苷酸序列和8個簡并堿基組成的隨機引物結合，然后進行線性預擴增和指數(shù)擴增，最終產(chǎn)生2 μg的全基因組DNA用于高通量測序。用Covaris S2系統(tǒng)超聲將400 ng純化好的DNA擴增產(chǎn)物打斷成150～250 bp片段，再用Qiagen純化試劑盒進行純化，DNA建庫試劑盒進行建庫(圖1)，HiSeq2500系統(tǒng)進行上機測序。

1.2.4數(shù)據(jù)分析 HiSeq 2500平臺全基因組擴增后的每個樣本產(chǎn)生約2 Mb reads的數(shù)據(jù)量，高質量的reads與hg19參考基因組進行比對。染色體拷貝數(shù)分析按以下方法進行：整個參考基因組分為若干個1 Mb大小不重疊的窗口，計算每個窗口的Reads數(shù)目，通過R語言對每個窗口GC含量矯正后的Reads 數(shù)目進行作圖，使拷貝數(shù)變異可視化。

1.2.5胚胎移植 活檢后的胚胎行玻璃化凍存，PGS檢測結果正常的胚胎將在復蘇周期中移植入宮腔，并進行個體化黃體支持。

1.3分析指標及判定標準本研究的主要觀測指標為胚胎染色體異常率、CPR，持續(xù)妊娠率(ongoing pregnancy rate，OPR)，流產(chǎn)率(miscarriage rate，MR)。異常胚胎率(%)=檢測回報異常的胚胎數(shù)目/送檢胚胎數(shù)×100%，CPR(%)=B超下可見孕囊的周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%，OPR(%)=持續(xù)妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%，MR(%)=流產(chǎn)周期數(shù)/妊娠周期數(shù)×100%。

圖2 染色體整倍性胚胎(46,XN)

圖3 多條染色體異常的胚胎[46,XN,-4(×1,mos*),13(×1,mos*),-21(×1,mos*),-22(×1,mos*)]

圖4 2號染色體單體，9號染色體三體的胚胎[46,XN,-2(×1),+9(×3)]

2 結果

2.1胚胎異常率本研究共對91例患者125個取卵周期的526枚胚胎進行PGS，其中卵裂胚74枚，囊胚452枚，526枚胚胎檢測結果顯示有355枚胚胎為染色體異常，胚胎染色體異常率為67.49%(355/526)。RSA患者83個PGS周期共檢測胚胎329枚，217枚胚胎為染色體異常，染色體異常率為65.96%(217/329)；高齡患者79個PGS周期數(shù)共檢測胚胎243枚，177枚胚胎為染色體異常，染色體異常率為72.84%(177/243)，合并RSA和高齡的患者10例，共37個取卵周期。見表1。本研究主要篩查出的染色體異常包括微小缺失、與重復(10 Mb以上的片段缺失和重復)和非整倍體 (mosaic， mos)表示嵌合疑似，圖2～4分別為其中3類染色體拷貝數(shù)檢測結果圖，其中圖2為整倍體胚胎，可用于移植，圖3為多條染色體異常的胚胎，圖4為2號染色體單體、9號染色體三體的異常胚胎，這兩類胚胎均不可用于移植。

表1 患者的染色體異常率與臨床妊娠結局[%(n/n)]

2.2PGS的妊娠結局本研究91例行PGS助孕患者共實施74個單胚胎凍融移植周期，臨床妊娠42例，CPR為56.76%(42/74)；自然流產(chǎn)發(fā)生1例，MR為2.38%(1/42)；持續(xù)妊娠41例，OPR為 55.41%(41/74)。其中符合RSA患者共進行了50個解凍移植周期，臨床妊娠28例，其CPR為56.00%(28/50)；持續(xù)妊娠27例，OPR為 54.00%(27/50)；自然流產(chǎn)發(fā)生1例，MR為3.57%(1/28)。高齡患者共進行了28個解凍移植周期，高齡患者的臨床妊娠16例，CPR為57.14%(16/28)；持續(xù)妊娠15例，OPR為 53.57%(15/28)；自然流產(chǎn)1例，MR為6.25%(1/16)。其中有10例患者合并有高齡和RSA，共行4次解凍移植周期，其中2例患者在持續(xù)妊娠中，1例流產(chǎn)，1例未孕。兩組分組中均納入了這10例患者。見表1。將高齡患者進一步分為35～40歲組和>40歲組觀察其臨床結局。35～40歲組患者送檢胚胎145枚，其中胚胎染色體異常95枚，胚胎異常率為65.51%(95/145)。35～40歲組患者共進行了22個解凍移植周期，臨床妊娠14例，CPR為63.63%(14/22)；自然流產(chǎn)1例，MR為7.14%(1/14)。>40歲組患者送檢胚胎98枚，其中胚胎染色體異常82枚，>40歲組的胚胎異常率為83.67%(82/98)。>40歲組患者共進行了6個解凍移植周期，臨床妊娠2例，CPR為33.33%(2/6)，其中>40歲組胚胎異常率明顯高于35～40歲組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，>40歲組的CPR和MR均低于35～40歲組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 兩組高齡患者臨床結局[%(n/n)]

3 討論

人類胚胎的染色體異常率在40%～60%，40歲以上女性染色體異常率可達80%。有報道表明<35歲的女性胚胎著床率約為30%，而40歲以上女性胚胎著床率僅為6%[5]，患者高齡及移植了非整倍體胚胎是導致IVF過程中胚胎著床率降低的主要原因。PGS 是早于產(chǎn)前篩查及產(chǎn)前診斷的遺傳學篩查方式，可通過篩查出染色體正常的胚胎改善IVF妊娠結局，在我國主要用于高齡、反復種植失敗、RSA及攜帶異常染色體的不孕患者[6]。

近年來隨著全基因組擴增技術的應用和發(fā)展，比較基因組雜交(comparative genomic hybridization, CGH)，第二代基因測序技術(next generation sequencing，NGS)因可進行全基因組的染色體篩查，漸取代了早前的熒光原位雜交技術，本研究中對所采取的MALBAC-NGS-PGS技術是一種新的PGS技術，具有均一性好、等位基因脫口率低、擴增成功率高等特點，已經(jīng)成功應用于單細胞全基因組擴擴增，及單個卵母細胞和精子測序[7]，與CGH相比在檢測異常染色體敏感性和準確性上并無差別，但只需要0.04 x的測序深度就可以進行全染色體篩查，且通量高，速度快， 成本低，利于PGS在臨床推廣使用[8]。

本研究采用MALBAC-NGS-PGS技術對高齡及RSA患者125個周期526枚胚胎進行PGS檢測，結果顯示，RSA和高齡患者(>35歲)胚胎染色體異常率分別達65.96%和 72.84%，其中40歲以上患者的胚胎異常率高達83.67%。 RSA及高齡患者行PGS后，選擇染色體正常的單胚胎移植CPR可達56.76%，MR僅為2.38%，進一步證實通過PGS可以有效篩查出高齡和RSA患者的非整倍體胚胎，降低因胚胎染色體數(shù)量異常導致的流產(chǎn)的風險，有效改善這兩類患者的妊娠結局。另外，還進一步將高齡人群以年齡40歲為界分為兩組進行比較。結果表明40歲以上組的患者非整倍體胚胎率明顯高于35～40組(P<0.05)，進一步驗證了Kuliev et al[9]和Pellestor et al[10]之前的研究，即認為女性年齡與胚胎染色體異常發(fā)生率成正相關的觀點。但是本研究中35～40歲組和>40組之間的CPR和MR差異均無統(tǒng)計學意義，這可能是由于本研究中>40歲組患者的移植周期數(shù)相對較少有關，因此還需進一步擴充樣本量，完善研究。

但PGS的臨床應用仍存在許多局限性，如 PGS檢測是一種侵入性檢查，可能會在一定程度上降低胚胎質量和發(fā)育潛能[11]；人類胚胎活檢的長期生物安全性尚未得到證實，有研究[12-13]表明胚胎活檢可對動物胚胎神經(jīng)和腎上腺發(fā)育產(chǎn)生負面影響；此外PGS需具備昂貴的儀器設備以及受過特殊訓練和經(jīng)驗豐富的胚胎學家，增加患者的經(jīng)濟成本[14]，但隨PGS技術的進一步完善和經(jīng)濟成本的下降，將在改善高齡、RSA患者及染色體異常攜帶者IVF結局方面發(fā)揮更大的作用。