VIP在肝癌中的表達(dá)及與巨噬細(xì)胞極化的相關(guān)性的研究

王 濤，葛勇勝，劉文斌，束清華，石 旭

肝細(xì)胞癌(簡(jiǎn)稱肝癌)是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的實(shí)體腫瘤之一[1],原發(fā)性肝癌患者由于多藥耐藥而預(yù)后較差[2]，患者總體復(fù)發(fā)率達(dá)到70%。雖然肝癌的診斷和治療手段不斷提升，但其結(jié)果仍不理想，早期對(duì)肝癌所形成的認(rèn)識(shí)以及評(píng)價(jià)重點(diǎn)為以臨床背景作為基礎(chǔ)的配套腫瘤分期(如：BCLC以及TNM分期)。而近些年來(lái)腫瘤微環(huán)境的概念越來(lái)越得到人們的重視，其在腫瘤的預(yù)后及評(píng)價(jià)中發(fā)揮重要作用，免疫細(xì)胞作為腫瘤微環(huán)境的腫瘤組成部分[3]，免疫細(xì)胞中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophage,TAM)被發(fā)現(xiàn)起著越來(lái)越重要作用。TAM一般可以界定為兩個(gè)基礎(chǔ)分類：經(jīng)典激活的促炎癥M1型，替代性M2型。前期研究[4]表明：M2型巨噬細(xì)胞在肝癌患者晚期階段的表達(dá)顯著高于M1型巨噬細(xì)胞，并且影響其預(yù)后。那是什么原因會(huì)導(dǎo)致晚期肝癌中M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)的差異促使進(jìn)一步探究。

血管活性肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)是由28個(gè)氨基酸組成的多肽，血管活性腸肽具有廣泛的生理作用，涉及各個(gè)系統(tǒng)。研究[5]顯示VIP與惡性腫瘤的關(guān)系密切,如:一些惡性腫瘤組織中VIP含量增加，能調(diào)節(jié)TNFα， IL-6,，IL-12和INOS，參與腫瘤的免疫逃逸，其原理可能與巨噬細(xì)胞的極化有關(guān)。然而，VIP與肝癌的關(guān)系鮮有報(bào)道，該研究通過(guò)該研究通過(guò)Western blot 法和實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)VIP在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)，同時(shí)免疫組化染色檢測(cè)肝癌組織和癌旁組織中VIP及巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68，M1巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD11c以及M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206的表達(dá)，初步探討肝癌組織中VIP的表達(dá)及其與巨噬細(xì)胞極化的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1病例資料以安徽省立醫(yī)院肝臟外科收治案例作為基礎(chǔ)，選擇2006年4月～2015年10月，進(jìn)行相關(guān)的切除標(biāo)本資料同時(shí)在相關(guān)的病理證實(shí)中確定歸屬于肝細(xì)胞性肝癌的石蠟標(biāo)本，選擇的標(biāo)本數(shù)量90例，其中男性標(biāo)本62例，女性28例，TNM分期為Ⅰ/Ⅱ級(jí)55例，Ⅲ/Ⅳ級(jí)35例。同時(shí)選定該院內(nèi)的肝膽胰實(shí)驗(yàn)室所存放的肝癌以及周邊組織的標(biāo)本共計(jì)20例，針對(duì)其開(kāi)展配套的Western blot以及qRT-PCR的檢驗(yàn)工作。選擇的案例在手術(shù)之前并沒(méi)有進(jìn)行化療、放療以及介入等相關(guān)的治療操作；這一分析得到了患者以及家屬的書(shū)面認(rèn)可，同時(shí)已經(jīng)通過(guò)了院內(nèi)倫理學(xué)委員會(huì)的審批程序。

1.2主要試劑CD11C抗體購(gòu)自美國(guó)abcam公司；VIP抗體、CD206抗體和CD68抗體均購(gòu)自北京bioss公司；免疫組化試劑盒和β-actin購(gòu)自北京中杉金橋公司；ECL超敏發(fā)光試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；PCR引物購(gòu)自上海生工生物工程公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1免疫組化染色 運(yùn)用免疫組化SP法檢測(cè)CD68、CD11c、CD206和VIP蛋白表達(dá)，所選肝癌標(biāo)本來(lái)自于醫(yī)院病理科，制成2 μm厚切片，過(guò)三道二甲苯及乙醇后，經(jīng)過(guò)抗原高溫還原，按1 ∶2 000加入VIP抗體(CD68為1 ∶400，CD206為1 ∶100，CD11c為1 ∶100)，4 ℃ 孵育過(guò)夜，加入通用型二抗37 ℃孵育 30 min，PBS洗片后，DAB顯色;隨后蘇木精復(fù)染，再經(jīng)酒精梯度脫水、中性樹(shù)膠封片。步驟均參照試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，對(duì)各分子進(jìn)行染色。

1.3.2Western blot 取肝癌及癌旁組織100 mg，增添相關(guān)的RIPA細(xì)胞裂解液1ml，在4 ℃，12 000 r/min條件下離心處理15 min，獲得蛋白，制配SDS-PAGE凝膠， 1 ∶4的比例增添5×SDS-PAGE緩沖液。在沸水狀態(tài)下加熱持續(xù)10 min，以此來(lái)實(shí)現(xiàn)充分變性的效果。樣品降低到室溫之后，上樣至SDS-PAGE孔就可以完成。對(duì)每孔的劑量為5～20 μl。濃縮膠實(shí)際采用的電壓參數(shù)是80 V。電泳結(jié)束后，分離蛋白并將蛋白至PVDF膜上，將膜放入預(yù)制的洗滌液之內(nèi)，持續(xù)漂洗5 min，VIP一抗(抗屬于兔抗1 ∶300稀釋；同時(shí)其中采用了10%的分離膠)4 ℃的狀態(tài)下低速搖動(dòng)過(guò)夜。1 ∶10 000進(jìn)行HRP標(biāo)記二抗的稀釋操作。在室溫環(huán)境中持續(xù)2 h。增添，洗滌3次。顯影、定影，結(jié)果拍照、掃描；同法用兔抗人β-actin作內(nèi)參對(duì)照；VIP條帶灰度值與β-actin灰度值之比用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.3qRT-PCR 參照TRIzol說(shuō)明書(shū)提取20例冰凍標(biāo)本中肝癌組織和癌旁組織總RNA，合成 cDNA，PCR擴(kuò)增條件為: 95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，經(jīng)過(guò)40個(gè)循環(huán)。VIP熒光定量引物序列F:5’-CTTGGGTCAACTTTCTGCCA-3’,R:5’-GGCGG-GTATAGTTGTCAGTG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度131 bp；內(nèi)參(β-actin)F:5’-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG-3’,R:5’-CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度180 bp；VIP mNA的表達(dá)量用 2ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算。

1.4結(jié)果判定免疫組化結(jié)果的判讀由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的不知患者臨床資料的病理科醫(yī)師雙盲讀片。染色評(píng)分：棕褐色3分，棕黃色2分，淺黃色1分，著色很弱或未著色為0分。陽(yáng)性百分率計(jì)算：光鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)高倍鏡視野，陽(yáng)性細(xì)胞百分率0～5%為0分，5%～50%為1分，50%～75%為2分，75%～100%為3分。兩者相乘結(jié)果為0分的記為陰性(-)，1～3分為弱陽(yáng)性(+)，4～6分為中等強(qiáng)度陽(yáng)性()，9分為強(qiáng)陽(yáng)性()，+～均判為陽(yáng)性；兩者相乘結(jié)果的分?jǐn)?shù)得分≥4分者即定為高表達(dá)，分?jǐn)?shù)<4分者即定為低表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1VIP在肝癌、癌旁及正常肝組織中qRT-PCR的相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果顯示，肝癌組織中mRNA相對(duì)表達(dá)水平(1.10±0.48)高于癌旁組織(0.22±0.13)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.88P<0.01)。見(jiàn)圖1。Western blot 法分析顯示，肝癌組織中 VIP相對(duì)含量(0.87±0.20)高于癌旁組織(0.46±1.56)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.57，P<0.01)。見(jiàn)圖2。

2.2免疫組化結(jié)果染色結(jié)果顯示VIP在肝癌組織及癌旁組織均有表達(dá)，表達(dá)部位是細(xì)胞質(zhì)，但肝癌組織細(xì)胞中陽(yáng)性表達(dá)率為80%(72/90)，明顯高于癌旁組織中的表達(dá)表達(dá)率29%(26/90)，見(jiàn)圖3。VIP的表達(dá)和臨床因素中患者肝硬化、患者年齡相關(guān)(χ2=12.63、4.756，P<0.05)，而與肝癌患者的腫瘤包膜、肝癌TNM分期、腫瘤大小等其他臨床病理特征無(wú)明顯相關(guān)性，見(jiàn)表1。同時(shí)結(jié)果顯示肝癌組織中VIP的表達(dá)與CD68的表達(dá)呈正相關(guān)性(r=0.443,P<0.05)，見(jiàn)表2；VIP的表達(dá)與CD206也呈正相關(guān)性(r=0.328,P<0.05)，見(jiàn)表3；而與CD11c呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.309，P<0.05)，見(jiàn)表4。

圖1 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)分析VIP在肝癌組織

圖2 肝癌及癌旁組織中VIP蛋白的表達(dá)

T:肝癌組織；N:癌旁組織；a、b、c、d ：4組配對(duì)的肝癌與癌旁組織

圖3 免疫組化染色檢測(cè)各指標(biāo)在癌和

A:VIP；B：CD68；C：CD206；D：CD11c；1：癌組織；2：癌旁組織

表2 VIP與CD68相關(guān)性(n)

表3 VIP與CD206相關(guān)性(n)

表4 VIP與CD11c相關(guān)性(n)

3 討論

最開(kāi)始是Said et al[6]在上世紀(jì)70年代對(duì)豬小腸的研究中報(bào)道VIP的，為一類特定形式的堿性多肽，內(nèi)部構(gòu)成為28個(gè)氨基酸殘基，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)五分之一是螺旋模式，而剩下的結(jié)構(gòu)不存在明顯的規(guī)律；人類的VIP基因位于6q24號(hào)染色體區(qū)域，核苷酸長(zhǎng)度為9 kb，該基因包括7個(gè)外顯子。其通過(guò)外周以及相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)分泌，具備擴(kuò)張血管、加快腸道運(yùn)用的功能，屬于是胰泌素/VIP族的一類物質(zhì)，同樣也是一類關(guān)鍵的腦腸肽，在胃腸道等身體的多個(gè)組織和器官中均存在，跟消化系統(tǒng)的健康狀況存在著直接的關(guān)聯(lián)[7]。VIP通過(guò)G蛋白藕聯(lián)受體(VPAC1、VPAC2、PAC1)同時(shí)利用及PI3K渠道，在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的功能。當(dāng)下研究[8]表明VIP跟免疫性能還有密切的關(guān)系。VIP能夠帶動(dòng)特定細(xì)胞出現(xiàn)抑炎因子IL-10，同時(shí)對(duì)其他類型的因子具備相應(yīng)的抑制功能。降低共刺激分子B7的表達(dá)；VIP治療可抑制腫瘤壞死因子、IL-6、IL-12和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)[9]。VIP參與了胃癌、前列腺癌及血液系統(tǒng)惡性腫瘤[10]多種腫瘤的生長(zhǎng)。研究[11]表明發(fā)VIP誘導(dǎo)的BCL-2家族蛋白磷酸化可通過(guò)Ras/MAPK和PKA信號(hào)通路在前列腺癌中抑制細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到腫瘤逃逸功能，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。研究[12]證實(shí)胃癌組織中VIP表達(dá)與胃癌組織中炎性細(xì)胞內(nèi)NKG2D、PI3K表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，而NKG2D-PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是腫瘤免疫細(xì)胞發(fā)揮免疫的重要信號(hào)通路。結(jié)腸癌患者血漿內(nèi)的VIP水平為(116±10.14)μg/ml，明顯高于正常健康人的水平(42.44±2.54)μg/ml。結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2在分化時(shí)，VIP表達(dá)的受體是增加的，用碘標(biāo)記HT29細(xì)胞株結(jié)腸癌表面的VIP受體，用放射性元素檢測(cè)儀檢測(cè)，隨即在溶酶體內(nèi)可檢測(cè)到放射性，說(shuō)明VIP受體是被溶酶體吞噬并分解，3 min后其放射性減少50%左右。同時(shí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[13]表明，VIP能促進(jìn)大鼠結(jié)腸癌的生長(zhǎng)，VIP受體拮抗劑協(xié)同結(jié)腸癌化療藥物作用于結(jié)腸癌模型鼠，能明顯增強(qiáng)療效，說(shuō)明VIP在結(jié)腸癌作用中主要還是起著促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的方向，而抑制VIP的作用，則能抑制腫瘤的效果。生理情況下VIP隨門(mén)靜脈血流進(jìn)入肝臟，大部分與肝細(xì)胞表面的VIPR進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)被溶酶體消化降解 ，肝硬化時(shí)肝功能障礙，VIP滅活減少, 其VIP血漿濃度升高，另有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[14]表明小鼠體內(nèi)的VIP的表達(dá)量是隨著年齡增長(zhǎng)而增加的，這和本實(shí)驗(yàn)證明高齡患者組織內(nèi)VIP表達(dá)高于低齡以及肝硬化患者VIP表達(dá)較高相一致。

TAM作為生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子趨化因子等分子的作用靶點(diǎn)，能改變腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤惡化。M1巨噬細(xì)胞型主要能分泌殺傷分子、炎癥因子、趨化因子等參與炎癥反應(yīng)、清除病原體，還可高提呈抗原，參與免疫應(yīng)答發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)；M2型巨噬細(xì)胞抗原提呈能力較弱，抑制了T細(xì)胞增殖，參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移，促進(jìn)血管和淋巴管生成等。最近的研究[15]表明anti-TAM作用的小分子抑制劑抑制腫瘤生長(zhǎng),如細(xì)胞毒性因子、唑來(lái)膦酸。然而這些對(duì)腫瘤抑制劑表現(xiàn)出低滲透和有限的影響，說(shuō)明抑制TAM作用主要是要選擇性抑制M2型巨噬細(xì)胞而不是M1型巨噬細(xì)胞的作用才會(huì)達(dá)到最佳的效果。本研究中結(jié)果顯示VIP與TAM標(biāo)志物CD68和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206的表達(dá)呈正相關(guān)性，說(shuō)明VIP可能促進(jìn)了巨噬細(xì)胞向M2型活化，用VIP類似物或受體拮抗劑來(lái)抑制TAM的作用將能選擇性的抑制M2巨噬細(xì)胞而不會(huì)抑制M1型巨噬細(xì)胞的作用，將能更好的抑制腫瘤生長(zhǎng)。這僅僅是從有限的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中得到的推論，需要更多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。