尋常型銀屑病患者皮損中C/EBPβ表達(dá)水平的研究

柳莉丹，劉紅芳，吉蘇云，李錦意，張 嬌，王曉華，陳永鋒

銀屑病是一種以紅斑鱗屑為皮膚表現(xiàn)的慢性炎癥免疫性疾病，伴有遺傳傾向，而轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平的研究是銀屑病遺傳背景研究的熱點(diǎn)。CCAAT /增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBP)是B-ZIP DNA結(jié)合蛋白家族，其作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)許多細(xì)胞類型的生長和分化，包括肝細(xì)胞、單核細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞等[1-2]。C/EBP通過對靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)，廣泛參與細(xì)胞增殖與分化、炎癥反應(yīng)、腫瘤的發(fā)生與凋亡、肝臟再生等生理過程。

在以角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖和分化的銀屑病中，C/EBPβ如何表達(dá)，是否參與了疾病的發(fā)生發(fā)展過程，目前國內(nèi)外文獻(xiàn)未有報道。為了探討C/EBPβ與銀屑病的關(guān)系，該研究檢測了尋常型銀屑病患者皮損以及對照組正常皮膚中C/EBPβ的分布及表達(dá)差異性，并分析C/EBPβ表達(dá)水平以及其與病情評價指標(biāo)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1病例資料22例尋常型銀屑病患者均為2016年12月～2017年5月廣東省皮膚病醫(yī)院皮膚科門診患者，臨床皮損和病理診斷均符合《臨床皮膚病學(xué)》第二版尋常型銀屑病診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 近3個月接受過系統(tǒng)治療(如糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、維A酸藥物等)、光化學(xué)治療；② 合并自身免疫性疾病者；③ 影響本研究的其他皮膚疾病(如炎癥性疾病、過敏性疾病、真菌感染性疾病及其他嚴(yán)重的慢性系統(tǒng)性疾病)；15例正常對照組為我院整形外科行整形手術(shù)者。兩組間性別及年齡匹配。所有入選者簽署知情同意書，研究通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查。

1.2主要試劑和儀器TRIzol試劑(廣州欣勵和生物科技有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)；SYBR Prime Ex TaqTMⅡ均購自日本TaKaRa公司；Anti-C/EBPβ單克隆抗體(美國Abcam公司)；DAKO酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG抗體(二抗)[基因科技(上海)有限公司]；引物合成及設(shè)計(jì)(上海生工生物工程股份有限公司)；Leica 2135石蠟病理切片機(jī)、Leica病理組織包埋機(jī)(德國Leica公司)；顯微鏡(日本olympus公司)；凝膠成像儀(上海天能有限公司);NanoDrop儀(美國Thermo Fisher Scientific 公司)；PCR儀(美國Bio-Rad公司)；light Cycler 480 PCR儀(瑞士Roche公司)。

1.3方法

1.3.1一般資料及標(biāo)本收集 收集患者一般資料(性別、年齡、病程、皮損及臨床癥狀等)，評估患者皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)，即PASI評分情況。簽署知情同意書后，手術(shù)室切除尋常型銀屑病患者(22例)皮損組織及對照組(15例)正常皮膚組織，一半10%福爾馬林液浸泡后石蠟包埋用于免疫組化，一半生理鹽水沖洗后液氮凍存用于PCR檢測。

1.3.2免疫組化染色法檢測 取包埋后的組織修剪邊緣后裝入切片機(jī)作4 μm切片，烘箱過夜進(jìn)行脫蠟，脫蠟后將標(biāo)本進(jìn)行阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS液沖洗后將標(biāo)本架置于pH 9.0抗原修復(fù)液中進(jìn)行修復(fù)(置于微波爐中中高火7 min,中底火15 min)，用自來水復(fù)溫后取適量Anti-CEBPβ抗體用一抗稀釋液稀釋至合適濃度(稀釋濃度1 ∶100)孵育標(biāo)本30 min,沖洗后滴加二抗孵育20 min，最后進(jìn)行DAB顯色，封片后用顯微鏡觀察C/EBPβ蛋白表達(dá)及分布(按照抗體說明書及文獻(xiàn)，C/EBPβ陽性表現(xiàn)為胞核出現(xiàn)黃色或棕色的顆粒狀物質(zhì)沉積)。C/EBPβ蛋白表達(dá)水平以平均光密度值(Image pro plus 6.0軟件分析圖像所得)表示。

1.3.3逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)(RT-PCR)檢測 ① 提取組織中總RNA(采用經(jīng)典TRIzol法，所有操作冰上進(jìn)行)：取出液氮中保存的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，稱重后置于研缽研磨組織組織至粉末狀(中途不斷加入液氮)；向組織內(nèi)加入適量組織裂解液TRIzol(100 mg組織/1 ml TRIzol),充分研磨混勻后將標(biāo)本收集于1.5 ml無酶EP管中，冰上靜置5 min；向EP管中加入0.2 ml氯仿萃取，劇烈震蕩，冰上靜置5 min后于4 ℃離心機(jī)進(jìn)行離心(12 000 r/min、20 min)，離心后收集上層水相，并加入等體積異丙醇，小心上下混勻6次，進(jìn)行RNA沉淀；再次將標(biāo)本置于4 ℃離心機(jī)中，離心12 000 r/min、10 min，可見EP管底部出現(xiàn)白色沉淀，即為所提取組織中總RNA；除去上清液，加入預(yù)冷的75%乙醇進(jìn)行沉淀清洗，小心上下混勻，防止RNA降解；清洗后去除液體于超凈工作臺進(jìn)行風(fēng)干，最后加入20 μl DEPC水進(jìn)行RNA溶解，其后用NanoDrop儀檢測RNA濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA,置于-80 ℃冰箱保存或用于實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)；② 進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR：以GAPDH作為內(nèi)參，C/EBPβ上游引物：5’-TCTCTGCTTCTCCCTCTGCC-3’，下游引物：5’-ACAGCAACAAGCCCGTAGG-3’ ；GAPDH上游引物：5’-AAGTATGACAACAGCCTCAAG-3’，下游引物：5’- TCCACGATACCAAAGTTGTC-3’；采用20 μl反應(yīng)體系，在PCR板中分別加入10 μl SYBR Premix Ex Taq、2 μl cDNA 、6.4 μl無RNase水、上下游引物各0.8 μl，實(shí)時熒光定量PCR儀上機(jī)檢測，軟件讀取C/EBPβ及GAPDH的Ct值；對數(shù)據(jù)進(jìn)行相對定量分析，利用所測Ct值，計(jì)算C/EBPβ mRNA相對表達(dá)量，本實(shí)驗(yàn)中采用2-ΔΔCt相對定量方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，其中ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對照組。

1.3.4相關(guān)性分析 按照銀屑病皮損面積及嚴(yán)重程度指數(shù)(psoriasis area and severity index，PASI)評分標(biāo)準(zhǔn)，記錄患者PASI評分，并進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，評估皮損組織中C/EBPβ平均光密度與PASI評分相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)對象基本資料分析22例尋常型銀屑病患者中，男13例，女9例；年齡17～78(40.95±16.609)歲；病程3個月～30年，平均(7.7±7.438)年；PASI評分為2.4～18.8分。15例正常對照組，男7例，女8例；年齡19～58(31.33±11.848)歲 。尋常型銀屑病患者與正常對照者在性別(χ2=0.734，P>0.05)、年齡構(gòu)成上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2尋常型銀屑病患者與對照組組織中CEBPβ表達(dá)及分布免疫組化染色法定位CEBPβ在尋常型銀屑病皮損中廣泛分布于表皮各層細(xì)胞胞核，以棘層上部及顆粒層為主，正常對照組則可見CEBPβ強(qiáng)烈表達(dá)于表皮各層細(xì)胞的胞核(圖1)；CEBPβ平均光密度值(0.204±0.582)低于對照組(0.273±0.439)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.894,P<0.001)。見圖2。

2.3尋常型銀屑病與正常對照組組織中CEBPβmRNA表達(dá)量RT-PCR方法檢測組織中CEBPβ mRNA表達(dá)量，結(jié)果表明：尋常型銀屑病患者CEBPβ mRNA(0.48±0.302)表達(dá)量低于正常對照組(0.754±0.194)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.11，P<0.005)。見圖3。

2.4組織中CEBPβ表達(dá)量與患者PASI評分相關(guān)性分析22例尋常型銀屑病患者PASI評分為(4.196±0.895)，相關(guān)性分析顯示組織中CEBPβ 蛋白的表達(dá)與患者PASI評分呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.642,P<0.005)。見圖4。

圖1 銀屑病組與正常對照組中C/EBP β表達(dá)

圖2 銀屑病組患者與正常對照組組織中CEBPβ平均光密度值

圖3 銀屑病組患者與正常對照組組織中CEBP β mRNA表達(dá)量

3 討論

銀屑病是一種多基因參與的紅斑鱗屑性皮膚病，通過免疫介導(dǎo)的共同通路最后引起角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)生增殖的慢性炎癥免疫性疾病。CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBP)是在肝臟、脂肪組織、血液細(xì)胞和內(nèi)分泌胰腺分化過程中選擇性表達(dá)的堿性區(qū)域/亮氨酸拉鏈(bZIP)轉(zhuǎn)錄因子[3]，包括6個家族成員，其中C/EBPβ可參與調(diào)控炎性細(xì)胞因子IL-α、IL-1β、IL-6、IL-17、IL-36α和INF-γ等的表達(dá)[4-6]，而這些細(xì)胞因子在銀屑病炎癥反應(yīng)中起到重要作用。

圖4 銀屑病皮損中C/EBPβ平均光密度值

C/EBPβ也稱作核因子白細(xì)胞介素-6(nuclear factor for IL-6，NF-IL6)，由于該基因mRNA有4個轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，故該蛋白包括LAP*、LAP和LIP三種主要亞型，其中LAP*、LAP為轉(zhuǎn)錄激活因子，而LIP為轉(zhuǎn)錄抑制因子[7]。C/EBPβ在小鼠和人表皮中高度表達(dá)在1997年已被提及，House et al[8]發(fā)現(xiàn)C/EBPβ豐富的表達(dá)于小鼠皮膚、毛囊及皮脂腺中，主要表達(dá)在基底層上部的三種角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，且比已知表達(dá)高水平C/EBP的其他組織中觀察到的水平更高。Zhu et al[9]研究發(fā)現(xiàn)在C/EBPβ缺乏的原代角質(zhì)形成細(xì)胞中，早期分化標(biāo)志角蛋白K1和K10的表達(dá)明顯增加，表皮是由角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)成的復(fù)層鱗狀上皮，表明該轉(zhuǎn)錄因子在復(fù)層鱗狀分化中可能起作用[8]。Oh et al[10]在皮膚癌研究中發(fā)現(xiàn)C/EBPβ可參與誘導(dǎo)p53的表達(dá)和細(xì)胞凋亡，同時Zhu et al[11]在小鼠試驗(yàn)中，證實(shí)C/EBPβ是化學(xué)誘導(dǎo)的皮膚乳頭狀瘤形成所必需的。

本研究顯示正常皮膚組織中C/EBPβ均一表達(dá)于表皮全層細(xì)胞胞核，而銀屑病皮損中C/EBPβ則主要表達(dá)在分化的上皮層，表皮分化過程中需要基因參與調(diào)控，推測C/EBPβ可能具有參與調(diào)控銀屑病表皮異常分化的能力。免疫組化顯示銀屑病組C/EBPβ的蛋白表達(dá)水平低于正常對照組，同時RT-PCR亦發(fā)現(xiàn)銀屑病皮損中mRNA的表達(dá)量與皮損中蛋白表達(dá)一致，結(jié)合C/EBPβ蛋白在銀屑病及正常對照組均表達(dá)于細(xì)胞核，以上均提示C/EBPβ可能是在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮其調(diào)控作用。本研究與既往實(shí)驗(yàn)[12- 13]均表明正常表達(dá)水平的C/EBPβ是表皮角質(zhì)形成細(xì)胞分化所必須的，其表達(dá)水平的下調(diào)可能參與了銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞的異常分化，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。C/EBPβ mRNA及蛋白水平變化均提示在銀屑病表皮的增殖和分化中其可能發(fā)揮抑制作用，這可能與C/EBPβ的亞型LIP發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用相關(guān)。為進(jìn)一步研究C/EBPβ與銀屑病的相關(guān)性,本研究分析了組織中C/EBPβ蛋白的表達(dá)與銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)(PASI評分)的相關(guān)性，結(jié)果顯示其表達(dá)與PASI評分呈負(fù)相關(guān)性，進(jìn)一步說明了C/EBPβ可能參與銀屑病皮損中角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖的過程，可作為一種反映銀屑病皮損嚴(yán)重程度的指標(biāo)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了C/EBPβ與銀屑病發(fā)病存在相關(guān)性，為后續(xù)研究提供了提供了新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和研究方向。然而C/EBPβ在銀屑病中是否通過調(diào)控細(xì)胞因子或者炎癥信號通路進(jìn)而發(fā)揮調(diào)控作用仍需進(jìn)一步的研究。