p38 MAPK通路在小型豬自體靜脈移植模型中的作用研究

黃墨林，張 銳，偉 俊，鄭遠彪，葛建軍

冠狀動脈旁路移植術(coronary artery bypass graft，CABG)作為冠狀動脈粥樣硬化型心臟病(coronary atherosclerotic heart disease，CHD)的主要方法，由于取材的限制，大隱靜脈作為橋血管的主要血管使得內膜增生成為了靜脈移植后通暢的主要障礙，雖然血管平滑肌細胞的遷移和增殖影響血管重塑過程，但尚未有系統(tǒng)預防靜脈移植物內膜增生的治療方法[1]。平滑肌細胞(smooth muscle cells，SMCs)的增殖、遷移以及合成分泌大量的細胞外基質是內膜增生和血管再狹窄的關鍵[2]，而其中的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase， MAPK)信號傳導通路與CABG術后橋靜脈再狹窄有著密切的關系。在MAPK家族中，p38 MAPK是較新的一個通路[3]，所以目前已有許多學者對此問題展開研究并成功建立了大鼠[4]、家兔[5]、狗[6]的頸靜脈移植模型，小型豬的大隱靜脈-頸內動脈模型[7-8]。但在臨床實踐中，冠脈的情況較頸動脈仍有差別，分枝更多，血流情況更復雜，手術難度更大。但完全模擬人的冠脈搭橋手術，在不停跳情況下建立豬的冠脈搭橋模型報道較少。有研究[9]表明豬的冠脈解剖更接近于人。所以在小型豬的冠脈搭橋模型上應用p38 MAPK通路的高度選擇性抑制劑SB203580(美國Selleck公司)干預，觀察靜脈橋血管術后增生以及p38、p-p38的表達情況，對p38 MAPK通路在CABG術后橋靜脈再狹窄中的作用進行探討，為臨床上進一步防治CABG術后血管狹窄提供新的思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物健康小型巴馬豬，雌雄不分，體質量35～40 kg，由泰州小型豬生產基地提供，術前正常喂養(yǎng)1周。

1.2主要實驗器械及實驗藥品ZS-MV-HX動物呼吸機(上海恒勤儀器設備有限公司)；JR2000D心電監(jiān)護儀(山東博科科學儀器有限公司)；GD350-B電刀(上海瀘通電子有限公司)； 7A-23B負壓吸引器(江蘇魚躍醫(yī)療設備股份有限公司)；BeneHeart D6除顫儀(上海三崴醫(yī)療設備有限公司)；搭橋器械一套(上海醫(yī)療器械有限公司手術器械廠)；KD-202石蠟切片機(金華科迪儀器設備有限公司)；舒泰50(WK001，法國virbac公司)；HE染色試劑盒(C0105，上海碧云天生物技術有限公司)；Western blot相關儀器。

1.3實驗過程動物實驗于安徽醫(yī)科大學動物實驗中心完成，經安徽醫(yī)科大學動物倫理委員會批準。

1.3.1實驗前準備 正常喂養(yǎng)1周后，術前禁食12 h，禁水4 h，稱重，準備手術臺，準備多巴胺、利多卡因、阿托品等搶救藥品。

1.3.2麻醉 給予舒泰2.5 mg/kg，鹽酸賽拉嗪2 mg/k進行肌注麻醉。麻醉后給予手術區(qū)域備皮，固定后于耳緣靜脈建立靜脈通道，氣管插管并連接呼吸機，參數(shù)：潮氣量10～12 ml/kg，氧濃度(FiO2)60%～70 %，通氣頻率(f)15～20次/min。并于一側后腿內側根部切開行股動脈穿刺，檢測動脈血壓及血氧飽和度，實驗組于術前1 h給予SB203580(3 mg/kg)灌胃，麻醉后在大號喉鏡輔助下插入胃管，深度大約豬身長一半長度，給予配好的溶劑3 mg/kg灌入，為防止返流，灌后應抬高豬的上半身1 h后開始手術。

1.3.3取大隱靜脈 取碘伏消毒胸前及雙側大腿內外側，鋪巾及無菌洞巾，于右側后腿背側關節(jié)外科行縱行切口，下至后腿第二關節(jié)，上至大腿根部，長約15～20 cm，組織剪剪開皮下筋膜，鈍性分離脂肪及結締組織，可見一條暗紫色粗長大隱靜脈，充分游離周圍組織，暴露靜脈，用組織剪剪開血管鞘膜，并用蚊氏鉗鈍性分離；然后用橡皮筋穿過血管下方，輕提血管，由遠心端向近心端緩慢游離靜脈；游離過程中盡量避免破壞血管外膜，用0號絲線或1號絲線結扎大隱靜脈細小分支，分支結扎完畢以后，以血管鉗夾閉遠心端，剪斷血管，用小型動物灌胃針插入血管內，1號線結扎固定，近端血管鉗夾閉后剪斷，取下后近端夾閉，遠端從橄欖頭注入肝素水(250 ml生理鹽水加12 500 U肝素)，觀察有無破口，破口處可用6-0prolene或7-0prolene線縫合，待檢查無破口后放入肝素水中備用。

1.3.4搭橋 胸前區(qū)常規(guī)消毒鋪巾，20號刀片沿胸骨中線切開皮膚，電刀逐層切開皮下組織、脂肪、肌肉層，分離并暴露胸骨，胸骨劈刀沿胸骨正中劈開胸骨，電刀止血，胸撐撐開胸骨，分離結締組織、胸腺組織、充分暴露心包和主動脈；剪開心包并懸吊，在左上肺靜脈上方縫一條紗條，懸吊并充分暴露心臟，側壁鉗夾閉部分主動脈，待心率血壓穩(wěn)定后用打孔器于夾閉部分打孔，修剪橋靜脈，并用6-0prolene線縫合橋靜脈遠端與主動脈側孔，夾閉橋靜脈近端，松開側壁鉗并檢查縫合口有無漏血。暴露冠脈左前降支中遠端，選擇分支較少的一段，以心表固定器固定，有口刀片分離靶血管周圍結締組織，冠脈刀切開小切口并以前揚剪刀擴大切口，塞入合適分流栓；二氧化碳吹管輔助暴露切口；用6-0prolene或7-0prolene線縫合橋靜脈近端與靶血管；吻合完成后開放血管，檢查吻合口有無漏血、狹窄。以1號絲線結扎原前降支，待心率，血壓穩(wěn)定后，止血，放入持續(xù)負壓引流管；鋼絲固定胸骨，逐層關胸。

1.3.5術中管理 術中每小時追加一次舒泰(計量為初始計量的1/3)，每小時追加一次肝素(計量為初始計量的1/2)，丙泊酚6～8 ml/h持續(xù)泵入維持麻醉；青霉素60 mg/kg靜滴預防感染，500 ml生理鹽水+1 g氯化鉀+1.25 g硫酸鎂補充液體和電解質。

1.3.6術后管理 術后單籠喂養(yǎng)觀察，持續(xù)靜脈補液，每天靜脈給予青霉素(60 mg/kg，分2次，待3 d后恢復自主進食，精神良好后可返回普通飼養(yǎng)籠。

1.3.7靜脈獲取 術后喂養(yǎng)4周，常規(guī)麻醉，開胸(操作同前)，分離黏連組織后取血管，觀察通暢情況。用于HE染色者10%的甲醛溶液浸泡固定，24 h后常規(guī)脫水，石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色(HE染色)；用于Western blot的部分放入凍存管中-80 ℃保存，提取蛋白，Westem blot法檢測目的蛋白，實驗豬可于心房注射Kcl處死。

1.3.8Western blot檢測p38、p-p38的表達 把取出的血管組織用剪刀盡量剪碎后放入勻漿器中，加入500 U蛋白裂解液，充分碾碎組織，用移液器將裂解液移至1.5 ml離心管中然后在4 ℃下12 000 r/min 離心5 min，取上清液分裝于1 ml EP管中。按照1 ∶4(上樣緩沖液 ∶上清液)的比例加入配制好的上樣緩沖液，放入100 ℃開水中煮30 min，固定蛋白。泠卻后放入-20 ℃冰箱保存。后每組蛋白進行SDS-PAGE電泳，根據β-actin蛋白的定量配平后，加入10%的凝膠孔中，依次進行：電泳(濃縮膠60 V，分離膠120 V約2 h)、轉膜(300 mA恒流1.5 h)、封閉(5%的脫脂牛奶常溫封閉2 h)、孵育一抗(英國Abcam公司)4 ℃孵育過夜、孵育二抗(英國Abcam公司)常溫搖床孵育2 h、Thermo Scientific SuperSignal West Pico Kit 化學發(fā)光底物顯影，分析周期蛋白表達。

2 結果

2.1各組存活及血管通暢情況假手術組(n=10)均成活，對照組(n=10)及SB203580組(n=10)各死亡1只，均補做實驗，術后各組動物傷口均愈合良好，未見感染、出血、傷口裂開等情況。術后靜脈橋均充盈良好，波動有力，除對照組2只因血栓形成造成橋血管阻塞(以于后期補做)，其余均通暢。

圖1 手中及術后部分肉眼觀圖片

圖2 HE染色結果×100

2.2橋血管內膜及中膜的病理變化

2.2.1血管肉眼觀情況 大體觀，移植靜脈均有不同程度的擴張、增厚、管壁水腫、管腔狹窄，對照組內膜、中膜增厚最為明顯，部分血管可見管腔次全閉塞，壞死物沉積。實驗組也可見管腔內增生，但增生程度明顯低于對照組，未見有管腔閉塞。假手術組增生情況最輕，管腔通暢情況良好，見圖1。

2.2.2HE染色結果 HE染色后，觀察各組內膜、中膜均有不同程度的增生，通過計算機分析顯示：SB203580組與對照組相比，SB203580組內膜厚度明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(t=1.45，P<0.05)。SB203580組與對照組相比，SB203580組中膜厚度明顯低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(t=3.19，P<0.05)。SB203580組與假手術組相比，SB203580組內膜增生厚度高于假手術，差異具有統(tǒng)計學意義(t=3.12，P<0.05)，見圖2、表1。假手術組僅模擬手術過程，不進行血管移植；對照組于手術前進行DMSO灌胃，后進行常規(guī)冠脈搭橋術；實驗組于術前1 h給予SB203580 3 mg/kg灌胃。

2.2.3Western bolt結果 各組血管均以Western bolt檢測p38和p-p38的蛋白產物，測量灰度值后進行統(tǒng)計學分析，SB203580組與對照組相比，結果顯示SB203580組的p38和p-p38的產物明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(t=2.12，P<0.05)，SB203580組與假手術組相比，SB203580組的p38和p-p38明顯高于假手術組，差異具有統(tǒng)計學意義(t=3.23，P<0.05)。見圖3。假手術組僅模擬手術過程，不進行血管移植；SB203580組于術前1 h給予SB203580 3 mg/kg灌胃；對照組術前給以DMSO灌胃，后進行常規(guī)冠脈搭橋手術。

表1 各組靜脈術后內膜、中膜增生情況比較

與SB203580組比較：*P<0.05 ；與假手術組比較：#P<0.05

3 討論

CABG術后靜脈橋再狹窄一直是CABG手術的一個重要問題，數(shù)據顯示CABG術后10年，30%的靜脈橋血管會發(fā)生再狹窄，40%的靜脈橋血管會發(fā)生閉塞[10]。靜脈橋血管再狹窄是一個多因素、長時間、多機制、涉及多個病理變化的過程[11]，目前研究機制表明：內皮細胞受損、平滑肌細胞的增殖與遷移、外膜細胞的纖維化、炎癥反應、缺血再灌注損傷以及血流動力學的改變都會影響到術后橋血管的再狹窄[12]。其病理過程主要包括：血栓形成、內膜增生以及后期的粥樣斑塊硬化。而內膜增生是導致前中期血管狹窄的主要因素。其原因主要是在橋血管獲取過程當中由于分離、結扎、離斷、縫合等操作，以及靜脈動脈化和血流動力學改變，都會導致血管內膜損傷，導致血小板聚集，激活炎癥反應，釋放大量細胞因子和炎性介質，連同受損內皮細胞分泌的一部分有絲分裂因子，促進SMCs的活化，收縮型轉化為合成型，分泌細胞因子和血管活性物質，如血小板衍生因子(PDGF)、5-羥色胺(5-HT)、血管緊張素Ⅱ(AT-Ⅱ)、胰島素生長因子等，這些活性物質及細胞因子再次促進SMCs大量增殖并向內膜遷移，同時產生高于正常水平的細胞外基質，引起血管新生內膜形成及管壁增厚，管腔狹窄，構成了冠脈旁路移植術后橋血管再狹窄的病理基礎。而后受損的內皮細胞與SMCs通過細胞因子的作用形成正反饋循環(huán)。SMCs的遷移、增殖和合成分泌大量的細胞外基質是內膜增生和血管再狹窄的關鍵[13]。本研究顯示靜脈移植術后4周，使用SB203580組的內膜增生明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義。因此研究內膜增生的變化過程和啟動基因，可以為臨床預防CABG術后靜脈橋的狹窄提供新的思路。

圖3 Western bolt結果

A:各組p38、p-p38表達結果；B: 各組蛋白測量灰度值比較

另一方面，靜脈管腔較一般冠狀動脈粗，并且與動脈相比缺少具有彈性的肌肉層，當移植到冠狀動脈上時，突然受到高于靜脈壓力約10倍的機械應力的刺激，并且在動靜脈吻合口處由于手術方式和吻合方法的不同，在吻合口處易形成亂流和渦流。研究[14]表明：過高或過低的切應力以及異常的振蕩頻率都會引起內皮細胞功能的紊亂，內膜增生以及血管狹窄往往首先發(fā)生在接口或者發(fā)生機械應力改變處。血液中脂質、血小板、細小血栓等會持續(xù)沉積于吻合口處，而生物機械應力會改變細胞內的生理信號傳導及基因表達，促進其分化、增殖和合成基質蛋白。橋靜脈在劇增的血管壓力下激活細胞生長所需的信號轉導通路中的MAPK。本實驗中SB203580組的p-p38表達明顯受到抑制，低于對照組，且SB203580組的內膜、中膜較假手術組明顯增生，證明靜脈動脈化后P38MAPK通路激活，參與了靜脈內膜的增生及血管重塑的過程。

內皮的損傷、炎癥反應、血流壓力產生的生物機械應力的變化，激活血小板及白細胞，并釋放大量炎癥介質和細胞因子，連同受損內皮細胞分泌的有絲分裂原因子，促進中膜SMCs的活化，使其表型發(fā)生變化，并分泌局部血管活性物質和細胞因子，這些活性物質再次促進中膜SMCs增殖并穿過血管內彈性層向內膜遷移，同時產生過量的細胞外基質，引起新生內膜形成及管壁增厚。受損的內皮細胞與SMC通過細胞因子的作用形成正反饋。可能是由于SB203580減輕了p38的磷酸化，抑制了內膜和中膜的增厚，減輕了正反饋作用，引起了p38蛋白表達的減少。

本實驗與大鼠、兔、小型豬的頸靜脈-動脈移植相比，手術過程模擬現(xiàn)在常用的不停跳冠脈搭橋技術，不論在血管獲取過程、長度、內徑、吻合過程以及后期的內膜增生過程，都更接近于臨床，證明在冠脈的復雜血流條件下，p38 MAPK通路對于CABG術后橋血管的再狹窄起到重要的作用，為進一步預防CABA術后血管再狹窄，提高術后橋血管通暢率提高理論依據。