PLK1表達(dá)對肺鱗癌細(xì)胞腫瘤生物學(xué)行為的影響的研究

陳 閣，張耀中，米 源，廖海江，王 雷

原發(fā)性肺癌目前是全球最常見的癌癥死因之一，每年約有138萬人死于肺癌，占癌癥總死亡人數(shù)的18.2%[1]。據(jù)統(tǒng)計57%患者在初診時發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，近年來隨著基因組學(xué)相關(guān)技術(shù)的蓬勃發(fā)展，晚期肺癌的治療步入了個體化分子靶向精準(zhǔn)治療時代[2]，隨著酪氨酸激酶抑制劑等靶向藥物問世，部分肺腺癌患者已經(jīng)從中受益，但目前肺鱗癌還未找到有效的治療靶點。Polo樣激酶1(polo-like kinase 1，PLK1)作為絲氨酸-蘇氨酸激酶家族之一，在前列腺癌[3]、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞[4]、急性髓性白血病[5]和宮頸癌[6]等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，其在啟動、維持和完成有絲分裂的過程中起著重要的作用，并且與生存預(yù)后關(guān)系密切，抑制PLK1表達(dá)可以通過干擾有絲分裂的多個階段導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，PLK1有望成為癌癥治療的潛在目標(biāo)[7]。目前關(guān)于PLK1 和肺鱗癌發(fā)生發(fā)展和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化關(guān)系的研究較少，該研究通過沉默PLK1基因表達(dá)，探討其與肺鱗癌細(xì)胞生長和侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制，旨在為肺鱗癌的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗主要試劑 人肺鱗癌細(xì)胞株SK-MES-1由河北省腫瘤研究所提供；胎牛血清購自美國Gemini公司；EMEM細(xì)胞培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；SilencerTMSelect PLK1、control siRNA、TaqManTMPLK1引物和探針(Hs00983227_m1)、TaqManTMGAPDH(Hs02758991_g1)購自美國Life Technologies公司； LipofectamineTMRNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑盒和Opti-MEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司；iScriptTMcDNA合成試劑盒、2× Laemmli Sample Buffer、 Tris/甘氨酸緩沖液、Tris/甘氨酸/蛋白電泳緩沖液和Mini-PROTEAN TGX 預(yù)制膠購自美國Bio-Rad公司；總RNA提取試劑盒購自德國 Qiagen公司；鼠抗人E-cadherin、Vimentin 和GAPDH單克隆抗體以及兔抗人PLK1單克隆抗體購自美國abcam公司；C-myc 兔抗人單克隆抗體購自美國cell signaling公司；West Femto最高靈敏度化學(xué)發(fā)光底物試劑盒、Pierce-BCA 蛋白分析試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；PVDF 膜購自美國Millipore公司；Transwell膜嵌套、matrigel 膠購自美國BD公司。

1.1.2實驗主要儀器設(shè)備 Synergy-HT 多功能酶標(biāo)儀購自美國BIO-TEK公司；ABI Prism 7900HT型熒光定量PCR儀購自美國applied biosystems公司；小型 Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽購自美國BIO-RAD公司，F(xiàn)alcon細(xì)胞培養(yǎng)瓶購自美國BD公司；NanoDrop 8000全光譜紫外-可見光分光光度計購自美國Thermo Scientific公司。

1.2實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 SK-MES-1細(xì)胞采用10%EMDM細(xì)胞培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)，將呈對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于6孔板上，每孔3×105個細(xì)胞數(shù)，融合生長達(dá)到60%左右時設(shè)空白對照組(Control組)和實驗組(siRNA組)，更換2% EMDM培養(yǎng)基，分別將 Lipofectamine 2000和siRNA稀釋于Opti-MEM，輕微混勻靜置5 min后將上述兩種稀釋液均勻混合，室溫放置20 min后加入6孔板內(nèi)，實驗分兩組：siRNA組和Control組，每組終濃度均為100 nmol/L，每組實驗重復(fù)3次。轉(zhuǎn)染6 h后更換新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。

1.2.2實時熒光定量PCR法檢測轉(zhuǎn)染前后PLK1基因的表達(dá) ① 總RNA的提?。篜BS洗滌轉(zhuǎn)染48 h后的SK-MES-1細(xì)胞，參照總RNA提取試劑盒說明書提取每組樣本總RNA，將純化的RNA于NanoDrop 8000分光光度計上檢測RNA濃度；② 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：參照iScriptTMcDNA合成試劑盒的說明書進(jìn)行每組樣本cDNA 的反轉(zhuǎn)錄，總反應(yīng)體系40 μl：iScript 逆轉(zhuǎn)錄酶2 μl、iScript反應(yīng)混合液8 μl、總RNA 500 ng、其余加R-Nase水，置于Veriti? 96-Well Thermal Cycler儀器中在25 ℃、5min，42 ℃、 30min，85 ℃、5min的條件下進(jìn)行每組樣本cDNA合成，所得cDNA在-20 ℃保存?zhèn)溆?。?實時熒光定量PCR擴增：用無R-Nase水將合成的每組cDNA稀釋10倍作為模板，取樣本cDNA 4.5 μl，Taqman 基因表達(dá)預(yù)混液5 μl， PLK1或GAPDH引物和探針0.5 μl，反應(yīng)體系共10 μl加到384孔板上(冰上)，瞬時離心后放置于ABI 7900HT PCR儀，95 ℃ 10 s；60 ℃ 10 s；72 ℃ 10 s的條件下進(jìn)行PCR擴增，40個循環(huán)。每組實驗重復(fù)3次。將實驗數(shù)據(jù)按照2-ΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3Western blot法檢測基因沉默PLK1基因后對肺鱗癌細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 將轉(zhuǎn)染48 h后SK-MES-1細(xì)胞用PBS洗滌，然后將6孔板置于冰上，在每孔中分別加入含有蛋白酶抑制劑的M-PER細(xì)胞總蛋白提取試劑100 μl，并收集每組樣本的總蛋白提取液，離心取上清液(樣本的細(xì)胞總蛋白)，按照BCA 法測定每組樣本的總蛋白濃度。于小型 Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽中加上Tris/甘氨酸/蛋白電泳液后，于Mini-PROTEAN TGX 預(yù)制膠中上樣每組樣本蛋白，設(shè)置電泳工作條件為200 V、50 min，電泳結(jié)束后用水和轉(zhuǎn)膜緩沖液沖洗凝膠15 min，用三明治法于Tris/甘氨酸緩沖液中轉(zhuǎn)膜至PVDF膜(冰浴)，設(shè)置工作條件100 V、1 h。將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜于5%脫脂奶粉的TBST液封膜1 h(室溫)，根據(jù)目的蛋白的不同KD值剪膜，分別加入一抗工作液PLK1(1 ∶1 000)、一抗工作液C-myc(1 ∶1 000)、一抗E-cadherin(1 ∶10 000)、一抗Vimentin(1 ∶10 000)、一抗 GAPDH(1 ∶20 000)，4 ℃搖床孵育過夜。第2天收集一抗后用TBST洗膜3次，每次10 min，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。每組實驗重復(fù)3次。將化學(xué)發(fā)光底物滴于PVDF膜上5 min后于暗室曝光顯影，以GAPDH作為內(nèi)參，使用 Image軟件測量目的蛋白(顯影條帶)灰度值。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測PLK1基因沉默后細(xì)胞周期的變化 將轉(zhuǎn)染48 h后SK-MES-1細(xì)胞用PBS洗滌，胰酶消化貼壁細(xì)胞，收集細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，冷PBS漂洗，加1 ml PBS吹打均勻重懸細(xì)胞，緩慢加入4 ℃、70%冰乙醇5 ml(置振蕩器上旋轉(zhuǎn)攪拌)，固定30 min以上。冷PBS漂洗3次去除乙醇，重懸細(xì)胞后加含40 μg碘化丙啶和100 μg RNaseA的PBS，避光4 ℃染色30 min。每組實驗重復(fù)3次。400目尼龍網(wǎng)過濾，采用MuticycleAV分析軟件對DNA細(xì)胞周期進(jìn)行擬合分析檢測每組樣品的DNA含量，PI 激發(fā)波長為488 nm。

1.2.5侵襲實驗檢測PLK1基因沉默后肺鱗癌細(xì)胞侵襲能力的變化 將放到4 ℃冰箱變?yōu)橐簯B(tài)Matrigel膠平鋪于聚碳酸酯膜。收集轉(zhuǎn)染后的SK-MES-1細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞計數(shù)后將含1×105個細(xì)胞的EMEM 200 μl置于Transwell小室上室。下室加含500 μl 10%FBS的EMEM培養(yǎng)液，然后放置于37 ℃、5% CO2恒濕溫箱內(nèi)孵育24 h，24 h后用棉棒擦去膜靠近內(nèi)室一面的基質(zhì)膠和細(xì)胞，甲醇室溫固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，清水漂洗，晾干膜，每組實驗重復(fù)3次。顯微鏡下隨機選取4個高倍視野(×400)觀察穿膜細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1實時熒光定量PCR檢測PLK1基因沉默后PLK1基因表達(dá)量的變化siRNA組PLK1 mRNA表達(dá)水平(0.35±0.05)較Control組(1.00±0.02)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=21.827，P<0.001)，見圖1。

圖1 實時熒光定量PCR法檢測PLK1 mRNA表達(dá)與Control組比較：***P<0.001

2.2Westernblot檢測蛋白表達(dá)SK-MES-1細(xì)胞PLK1、E-cadherin、Vimentin和C-myc蛋白的表達(dá)用Image軟件測量：siRNA組PLK1蛋白表達(dá)(0.55±0.03)較Control組 (1.00±0.02)顯著減少(t=24.65,P<0.001)，E-cadherin蛋白表達(dá)(1.79±0.04)較Control組(1.00±0.03)顯著增加(t=-30.60,P=0.000)，Vimentin蛋白表達(dá)(0.32±0.02)較Control組(1.00±0.02)顯著減少(t=47.03,P<0.001)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；C-myc蛋白表達(dá)(0.42±0.03)較Control組(1.00±0.04)明顯減少(t=21.42,P<0.001)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；見圖2。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期的影響結(jié)果顯示：siRNA組G2/M期細(xì)胞為(26.27±0.80)%，與Control組(20.67±0.85)%比較顯著增高(t=-8.30,P=0.001)；siRNA組S期細(xì)胞為(22.70±1.95)%，與Control組(26.93±0.32)%比較顯著降低(t=3.707 ,P=0.021)；siRNA組G0/G1期細(xì)胞為(51.00±1.15)%，與Control組(52.40±0.62)%比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.849,P=0.138)，見表1。

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染肺鱗癌PLK1后細(xì)胞周期的變化

與Control組比較：*P<0.05

2.4Transwell侵襲實驗與Control組穿膜細(xì)胞數(shù)(73.00±4.51)比較，siRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)(36.00±2.08) 明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.903，P<0.001)，見圖3。

圖2 Western blot法檢測SK-MES-1細(xì)胞中PLK1、E-cadherin、Vimentin和C-myc蛋白表達(dá)

圖3 沉默PLK1基因?qū)K-MES-1細(xì)胞侵襲能力的影響 ×400

3 討論

PLK1是PLK家族成員之一，其作為細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵蛋白在細(xì)胞有絲分裂調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用。目前研究[8- 9]表明PLK1在多種腫瘤組織中存在顯著過表達(dá)的現(xiàn)象，這與腫瘤的生物學(xué)行為以及患者的預(yù)后等密切相關(guān)，靶向特異性抑制PLK1基因表達(dá)可有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，而小RNA干擾技術(shù)(small interfering RNA，siRNA)作為雙鏈RNA分子介導(dǎo)序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù)，因為具有高度特異性和高效性，目前在惡性腫瘤的研究及治療等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。由于預(yù)后不良的非小細(xì)胞肺癌患者表達(dá)高水平的PLK1[10]，因此 PLK1可以作為靶向治療很好的候選基因，并可用來作為腫瘤標(biāo)志物，但目前尚未完全闡明PLK1如何調(diào)控肺鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為，本研究通過應(yīng)用siRNA沉默SK-MES-1細(xì)胞PLK1基因表達(dá)，結(jié)果顯示SK-MES-1細(xì)胞中存在PLK1高表達(dá)現(xiàn)象，RNA干擾可顯著減少腫瘤細(xì)胞PLK1 mRNA和蛋白表達(dá)。

細(xì)胞周期是細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞周期蛋白激酶以及細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑等多個蛋白調(diào)節(jié)的有序事件，細(xì)胞周期紊亂導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。C-myc癌基因?qū)俸说鞍谆颍哂修D(zhuǎn)化細(xì)胞的能力，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化及惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮關(guān)鍵作用，C-myc癌基因擴增與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和演變轉(zhuǎn)歸具有重要關(guān)系。PLK1作為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子具有在細(xì)胞分裂間期可以促進(jìn)中心體成熟，促進(jìn)細(xì)胞周期由G2期進(jìn)入M期以及PLK1 促進(jìn)染色體分離等功能，對細(xì)胞周期中各大重要事件的順利進(jìn)行以及周期相關(guān)檢驗點的調(diào)控中均發(fā)揮重要作用。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)對兩組肺鱗癌細(xì)胞所處細(xì)胞周期的分布進(jìn)行分析，結(jié)果顯示 siRNA組與Control組相比可將更多細(xì)胞阻滯于G2/M期，并且可以下調(diào)C-myc表達(dá)，這與Berges et al[9]和Amani et al[11]采用PLK1靶向抑制劑發(fā)現(xiàn)可以通過顯著阻滯細(xì)胞于G2/M期導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡增加的結(jié)果相一致，表明PLK1在肺鱗癌細(xì)胞異常增殖過程中起著重要作用，靶向抑制PLK1后可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞因失去正常G2/M檢查點的調(diào)控并且下調(diào)C-myc表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的生長。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化主要表現(xiàn)為E-Cadherin等上皮表型標(biāo)志表達(dá)下調(diào)，而N-Cadherin、Vimentin 等間質(zhì)表型標(biāo)志表達(dá)上調(diào)。通過EMT，腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力顯著增強，并且與患者預(yù)后密切相關(guān)[12-14]。Vimentin作為存在于間質(zhì)細(xì)胞中的一種中間纖維蛋白在腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、黏附和上皮癌的EMT中發(fā)揮重要作用，可作為抗腫瘤轉(zhuǎn)移研究和治療的新靶點[15]。Cai et al[16]研究發(fā)現(xiàn)PLK1 可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和EMT轉(zhuǎn)化。本研究表明抑制PLK1表達(dá)后可導(dǎo)致肺鱗癌細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào)，Vimentin蛋白表達(dá)下調(diào)，并且侵襲實驗證實敲掉PLK1基因后可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，侵襲能力降低，其原因可能是PLK1通過誘導(dǎo)肺鱗癌腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致E-cadherin下調(diào)，Vimentin表達(dá)上調(diào)所致。

綜上所述，本研究顯示PLK1與肺鱗癌生物學(xué)行為關(guān)系密切，可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長增殖和誘導(dǎo)EMT促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移，本研究為尋找靶向PLK1相關(guān)的抗腫瘤藥物研究奠定了基礎(chǔ)，PLK1有望成為肺鱗癌分子靶向治療的一個新選擇。