熒光共振能量轉移(FRET)體系的構建及其驗證

錢月嬌，馮鈺斌，錢學文，朱傳君，李 鴿，盧 多，陳飛虎

熒光能量共振轉移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)，是較早發(fā)展起來的一門技術[1]。該技術是基于兩個熒光源針對其空間距離的差異表現(xiàn)出信號變化的現(xiàn)象而形成的，適用于活細胞和固定細胞的各類分子，不破壞研究對象的活性和空間構象，具有高靈敏度和高分辨率，并能夠清晰成像，最直觀地觀察到蛋白質-蛋白質間相互作用的定位及定量信息[2-4]。該研究在大腸桿菌系統(tǒng)構建了該體系，且明確了測量細胞內與細胞外信號的可行性。已有研究為了證實距離足夠近可以產(chǎn)生FRET信號，構建過該體系，但其載體酶切位點較少，重在通過酶切確定FRET信號的消失[5-6]。為此該研究選用具有多酶切位點的載體，重在后續(xù)用于具體功能檢測而構建的一個新體系。由于兩個熒光源蛋白編碼基因非常相似[7]，在體系構建過程中存在一定的難度。該體系在藥物研究中可以提供對生物大分子之間相互作用檢測，進一步可以成為靶向分子間相互作用藥物篩選手段。

1 材料與方法

1.1質粒與菌株質粒pET28a(+)由中國醫(yī)學科學院藥物研究所實驗室留存；大腸桿菌(E.coli)Trans1-T1、Rosetta(DE3)菌株感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2工具酶及主要試劑DNA模板pEYFP-N1、pECFP-N1購自普如汀生物技術(北京)有限公司；PCR引物和測序均由睿博興科生物技術有限公司完成；限制性內切酶Nde I、BamH I、Not I、Xho I購自北京經(jīng)科宏達生物技術有限公司；T4連接酶購自NEB(北京)公司；高保真Taq DNA聚合酶、1 000 bp DNA Marker、蛋白質標志物購自北京全式金生物技術有限公司；Pure Plasmid Mini Kit、Gel Extraction Kit均購自北京康為世紀生物科技有限公司；Agarose購自上海拜力生物科技有限公司；Agar、Gel Green、YEAST EXTRACT、TRYPTONE購自北京蘭伯瑞生物技術有限公司；IPTG、卡納霉素、氨芐霉素、氯霉素購自上海捷瑞生物工程有限公司；Tris-HCl、咪唑購自上海翊圣生物科技有限公司；Ni柱、分子篩層析柱購自通用電氣公司(GE)；蛋白濃縮管(milipore)購自北京希凱創(chuàng)新科技有限公司。

1.3工程質粒的構建根據(jù)已知的ECFP、EYFP的編碼DNA序列設計引物，并參考空載pET28a(+)的序列，設置目的片段的酶切位點Nde I、BamH I以及Not I、Xho I，N端CFP和N端YFP的上下游引物為：5′-GGGAATTCCATATGGTGAGCAA GGGCGAGG-3′，5′-CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTC CATGC-3′；C端CFP和C端YFP的上下游引物為5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCGTGAGCAAGGGCGA GG-3′，5′-CCGCTCGAGCTTGTACAGCTCGTCCATGC-3′。再將pEYFP-N1和pECFP-N1作為DNA模板，分別進行常規(guī)PCR反應。PCR反應體系均為(50 μl)：2×Taq DNA聚合酶反應混合液 25 μl，上下游引物(10 μmol/L)各2 μl，DNA模板 0.25 μg，加ddH2O至50 μl。PCR的反應過程均為：① 95.0 ℃預變性5 min； ② 開始進行30個循環(huán)：95.0 ℃變性1 min，(50.0±6.0)℃退火1 min，72.0 ℃延伸30 s；③ 循環(huán)結束；④ 72.0 ℃終延伸10 min 。DNA瓊脂糖凝膠(1%)電泳分離PCR產(chǎn)物與模板DNA，使用Gel Extraction Kit回收PCR產(chǎn)物，并用紫外分光光度儀測量其回收后的濃度；再將空載pET28a(+)與膠回收PCR產(chǎn)物分別進行雙酶切處理。N端CFP和N端YFP工程質粒構建的雙酶切體系為(40 μl)：Green buffer(10×)4 μl、DNA總量為1.8 μg、Nde I 2 μl、BamH I 2 μl、加ddH2O 至40 μl。37 ℃，過夜。將過夜雙酶切的質?；騊CR產(chǎn)物再分別進行切膠回收，測其濃度。最后將回收的載體與目的片段按一定比例(1 ∶3～1 ∶9)混合，并使用T4連接酶，16 ℃過夜連接，連接體系為(10 μl)：T4連接酶緩沖液 1 μl，回收的目的片段 + 載體8 μl，T4 DNA連接酶1 μl。同時設立空白對照組。連接產(chǎn)物與空白對照組分別轉化至Trans1-T1菌株，37 ℃過夜恒溫孵育。后續(xù)通過菌落PCR或雙酶切驗證初篩陽性克隆，最后的結果以測序公司的測序結果為準；C端CFP和C端YFP工程質粒的構建方法同上，只是將PCR反應中的上下游引物換成C端的上下游引物，且將限制性內切酶換為Not I、Xho I進行雙酶切反應。N端CFP和C端YFP融合蛋白工程質粒的構建，是將構建好的N端CFP工程質粒和構建好的C端YFP工程質粒分別用Not I、Xho I進行雙酶切反應，切膠回收測其回收產(chǎn)物的濃度，連接轉化，測序確定陽性重組克??；N端YFP和C端CFP融合蛋白工程質粒的構建，則是將構建好的N端YFP工程質粒和構建好的C端CFP工程質粒分別用Nde I、BamH I進行雙酶切反應，切膠回收測其回收產(chǎn)物的濃度，連接轉化，測序確定陽性重組克隆。

1.4工程蛋白的誘導表達及其鑒定陽性重組質粒分別轉化至Rosetta(DE3)菌株中，挑單個菌落于加有卡納霉素(終濃度為50 μg/ml)、氯霉素(終濃度34 μg/ml)的LB培養(yǎng)基中，置于搖床中37 ℃、220 r/min過夜振蕩培養(yǎng)。按1 ∶50的轉接比轉接入新的加有抗生素的LB培養(yǎng)基中，搖床振蕩培養(yǎng)到OD值為0.6，加入IPTG進行誘導，IPTG濃度分別設為0.1、0.5、1 mmol/L 3個梯度；溫度分別設為37、16 ℃；誘導時間分別設為37 ℃為2 h、16 ℃則過夜；同時設立未誘導組作為空白對照。收集誘導的菌液和未誘導的菌液用SDS-PAGE電泳檢測(菌液離心后放-80 ℃冰箱凍融破碎，未95 ℃加熱變性)，用熒光凝膠成像系統(tǒng)檢測其熒光，同時用考馬斯亮藍染色觀察蛋白條帶位置，確定合適的誘導表達條件以及鑒定目的蛋白。

1.5重組蛋白的純化配制Ni柱純化緩沖液為A液：500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)，甘油5%(v/v)；B液：150 mmol/L NaCl，250 mmol/L 咪唑(pH 8.0)，甘油5%(v/v)；分子篩純化緩沖液為150 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)，甘油5%(v/v)。純化步驟：取保存于-80 ℃冰箱誘導表達的菌沉淀(500 ml菌液離心)至于冰上，讓其慢慢解凍，A、B液中分別按1 ∶100加入PMSF(50 mmol/L)，1 ∶1 000加入芐脒(1 mol/L)(現(xiàn)用現(xiàn)加)，菌沉淀加入A液至5 ml，至冰上超聲破碎2 min，再加入50 μl MgCl2(1 mol/L)，50 μl DNase I(10 mg/ml)，冰上放置30 min，18 000 r/min，4 ℃離心取上清液加入用A液平衡過的Ni柱(1 ml)中，進行純化。純化程序為：0的B液洗脫10 ml，10%的B液洗脫至15 ml，每管收集4 ml；而后用100%的B液拉梯度洗脫到22 ml，每管收集0.5 ml；再用100% B液繼續(xù)洗脫到30 ml，每管收集0.5 ml；100% B液洗脫至紫外趨平，每管收集4 ml。根據(jù)出峰位置取樣進行SDS-PAGE電泳，獲取目的蛋白，觀察蛋白純度，并用蛋白濃縮管濃縮至500 μl。將濃縮后的蛋白進一步用分子篩(superdex 200)進行分離，同樣根據(jù)出峰位置取樣跑SDS-PAGE膠獲得目的蛋白，并濃縮至200 μl，測其濃度后分裝保存于-80 ℃冰箱。

1.6FRET體系的驗證將純化后的N端CFP、N端YFP、CFP-YFP、YFP-CFP四種蛋白以相同的摩爾濃度(12.7 μmol/L)加到96孔板中，每孔200 μl(1 μl蛋白+199 μl ddH2O)，用酶標儀分別在激發(fā)光430、480 nm時對發(fā)射光進行掃描，并在發(fā)射光510 nm處對激發(fā)光進行掃描，由此確定本實驗所用的黃色熒光蛋白和青色熒光蛋白所對應的的激發(fā)波長和發(fā)射波長，以及在波長430/480 nm和480/530 nm處檢測其熒光值的變化情況；并平行進行了4種蛋白誘導表達后的菌液，將其離心除去LB培養(yǎng)基，以降低酶標儀檢測時可能的背景值，再以等量T.S.E(10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5, 100 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA)進行重懸，測其四者菌液的OD值，以相同OD值(1.6)菌液加到96孔板，每孔200 μl，用酶標儀進行檢測。

2 結果

2.1目的基因PCR擴增及陽性克隆鑒定C端CFP和N端CFP目的片段的擴增，退火溫度均分別設為50、55、60 ℃，同時進行PCR反應，反應結束后，1%瓊脂糖凝膠電泳可見720 bp的DNA片段，與預期序列大小均一致，見圖1A。而C端YFP目的片段的擴增，退火溫度分別設為50.5、55.5、60.3 ℃；N端YFP目的片段的擴增，退火溫度分別設為45.5、50.4、55.2 ℃，同時進行PCR反應，反應結束后，1%瓊脂糖凝膠電泳可見720 bp的DNA片段，與預期序列大小均一致，見圖1B。連接產(chǎn)物轉化至Trans1-T1后搖菌提質粒進行菌落PCR驗證，1%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示在720 bp有電泳條帶的出現(xiàn)，與預期結果一致，見圖1C。測序結果分別進行BLAST比對和軟件分析后，顯示pNYFP、pCYFP、pNCFP、pCCFP、pYFP-CFP、pCFP-YFP重組質粒均構建成功，見圖2。

2.2小量誘導表達與目的蛋白的鑒定YFP-CFP蛋白和CFP蛋白同時在37 ℃，2 h，IPTG分別為0.1、0.5、1 mmol/L以及在16 ℃，過夜，IPTG分別為0.1、0.5、1 mmol/L的條件下進行小量誘導表達實驗后，同時進行SDS-PAGE電泳，熒光凝膠成像系統(tǒng)檢測其熒光顯示IPTG誘導目的蛋白的適宜條件：CFP蛋白16 ℃，過夜表達；YFP-CFP蛋白37 ℃，2 h，均對IPTG在3個濃度時沒有明顯區(qū)別，且YFP-CFP蛋白熒光的位置明顯高于CFP蛋白熒光的位置，符合兩者的蛋白大小，見圖3A。本實驗所誘導蛋白均采用IPTG 0.1 mmol/L，16 ℃過夜表達?？捡R斯亮藍染色后，可見CFP蛋白在25～35 ku之間，YFP-CFP蛋白在60～75 ku之間，與目的蛋白大小保持一致，且空白對照組沒有目的蛋白的表達，見圖3B。

2.3蛋白純化蛋白(以CFP為例)經(jīng)過Ni柱純化顯示，從咪唑濃度為65 mmol/L左右的洗脫液中初步分離得到目的蛋白，蛋白大小在25～35 ku之間，與預期蛋白大小一致。分子篩層析分離結果顯示得到了較純的目的蛋白，見圖4。

圖1 目的基因PCR擴增及菌落PCR驗證

M：1 000 bp DNA Marker；A：1～3：C端CFP目的片段PCR擴增結果；4～6：N端CFP目的片段PCR擴增結果；B：1～3：C端YFP目的片段PCR擴增結果；4～6：N端YFP目的片段PCR擴增結果；C：N端CFP、YFP，C端CFP、YFP重組質粒菌落PCR驗證結果；1：沒有加樣；2：陽性對照；3：陰性對照；4：pNCFP；5：pNYFP；6：pCCFP；7：pCYFP

2.4FRET體系的驗證分別在蛋白條件下和菌液條件下進行了驗證。首先在蛋白條件下，酶標儀檢測FRET信號：4種蛋白以相同摩爾濃度分別加到96孔板中，在激發(fā)波長為430 nm下，對發(fā)射波長在450～600 nm范圍內進行掃描，而后將數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理繪制成圖，見圖5，可以檢測到CFP在480 nm處有最大峰值，且在510 nm處伴隨有肩峰的存在，而YFP在530 nm處有最大峰值，同時對其激發(fā)波長在480 nm時，對發(fā)射波長在500～600 nm范圍內進行掃描，并將數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理繪制成圖，見圖6，可以看到CFP隨著波長的增大，逐漸降低，YFP在530 nm處熒光值達到最高峰值，表明該實驗所用的CFP最適激發(fā)波長為430 nm，發(fā)射波長為480 nm和510nm，而YFP最適激發(fā)波長為480 nm，發(fā)射波長為530 nm。同時在發(fā)射波長510 nm處，對激發(fā)波長在400～490 nm范圍內進行掃描，見圖7。綜合三圖，構建的YFP-CFP或CFP-YFP融合蛋白較單獨存在的YFP和CFP而言，可以很明顯地看到黃色熒光大幅度上升，而青色熒光蛋白大幅度減少，即FRET體系構建成功。同時將其用酶標儀在430/530 nm和430/480 nm處進行檢測，其結果與酶標儀掃描結果一致，見表1。其次在菌液條件下，酶標儀檢測FRET信號：雖然熒光值明顯降低，且FRET現(xiàn)象不如蛋白條件下的更加明顯，但依舊可以較為清晰地看到FRET現(xiàn)象的產(chǎn)生，且可以看到陰性對照組YFP+CFP無FRET現(xiàn)象產(chǎn)生，與預期結果保持一致，見表2。

圖2 測序結果BLAST比對及軟件分析A：pNCFP；B：pCCFP；C：pNYFP；D：pCYFP；E：pCFP-YFP；F：pYFP-CFP

圖3 SDS-PAGE檢測IPTG小量誘導表達情況

M:Marker;A：熒光凝膠成像系統(tǒng)檢測熒光結果；B：考馬斯亮藍染色結果；1～7：YFP-CFP蛋白的表達結果；M：Marker；7：空白對照，16 ℃，未加IPTG，過夜；8～14:CFP蛋白的表達結果；14：空白對照，16 ℃，未加IPTG，過夜

圖4 蛋白純化的峰圖以及SDS-PAGE電泳檢測的結果圖

A：CFP蛋白過Ni柱的峰圖，橫坐標是洗脫體積(ml)，縱坐標是響應值(mAU)；B：CFP蛋白過Ni柱后SDS-PAGE電泳檢測結果；M：Marker；1～12：過Ni柱后的洗脫樣品；C：粗制備的CFP蛋白進一步過分子篩的峰圖，橫坐標是洗脫體積(ml)，縱坐標是響應值(mAU)；D：粗制備的CFP蛋白過分子篩后SDS-PAGE電泳檢測結果；M：Marker；1～10：過分子篩后的洗脫樣品

表1 酶標儀同時對黃色熒光蛋白和青色熒光蛋白進行檢測

圖5 激發(fā)波長430 nm時對發(fā)射波長在450～600 nm范圍內進行掃描A：CFP蛋白；B：YFP蛋白；C：CFP-YFP融合蛋白；D：YFP-CFP融合蛋白

圖6 激發(fā)波長480 nm時對發(fā)射波長在500～600 nm范圍內進行掃描A：CFP蛋白；B：YFP蛋白；C：CFP-YFP融合蛋白；D：YFP-CFP融合蛋白

圖7 發(fā)射波長510 nm時對激發(fā)波長在400～490 nm范圍內進行掃描A：CFP蛋白；B：YFP蛋白；C：CFP-YFP融合蛋白；D：YFP-CFP融合蛋白

表2 酶標儀同時對黃色熒光蛋白和青色熒光蛋白進行檢測

3 討論

本課題旨在建立一種行之有效的FRET體系，成功構建了YFP-CFP、CFP-YFP作為陽性對照，YFP+CFP作為FRET體系的陰性對照。然后對其進行了充分的驗證實驗，不僅對其在蛋白條件下進行了驗證，且在菌液條件下進行了驗證，酶標儀結果均顯示青色熒光大幅度減弱，黃色熒光大幅度增強，即FRET現(xiàn)象的產(chǎn)生，為相關研究者提供了詳細而全面的protocol，但由于雜蛋白的影響，致使菌液條件下的現(xiàn)象不如蛋白條件下的現(xiàn)象明顯。

隨著蛋白質間相互作用逐漸成長為一類新興的藥物靶點，快捷簡便的功能檢測方法勢必會有益于藥物研究的推進。當前實驗室一般比較常用的檢測蛋白-蛋白相互作用的方法包括酵母雙雜交、噬菌體展示、免疫共沉淀、等溫滴定量熱、表面等離子共振、熱泳動以及熒光共振能量轉移等技術[8-9]。各種技術比較起來，熒光信號屬于一種比較靈敏且易于觀察的報告形式，配之以生長周期短、遺傳背景比較清楚、基因操作方法比較成熟的大腸桿菌異源表達體系，有利于快速形成一個適用于多種蛋白質間相互作用的檢測方法[10]。誠然，大腸桿菌體系不能表達所有異源蛋白質，可能面臨表達水平低、蛋白質折疊錯誤、修飾欠缺等多種問題，但是這并不能也從來沒有阻礙其成為一個廣泛應用的異源蛋白表達體系。同時，大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌，具有兩層細胞膜結構，可能在藥物篩選中有利于對藥物遞送能力的檢測。同樣使用熒光信號檢測蛋白質間相互作用的方法還有熒光偏振技術，但是該技術要求熒光標記分子的分子量不能太大，以避免對其偏振能力造成較大的影響，因此與熒光共振能量轉移技術相比有更多的局限性。

總之，F(xiàn)RET技術的應用訖今為止非常的廣泛，也是目前研究蛋白-蛋白相互作用中非常有價值和發(fā)展?jié)摿Φ囊环N研究方法。今后的目標主要是以活體細胞和動物作為載體，在其生理條件下實時、動態(tài)地闡明分子間的相互作用規(guī)律和分子內的構象變化，加深對生命活動基本規(guī)律的認識。另外與轉基因等生物技術的結合，將其應用到細胞分子水平的高通量藥物篩選中去，也十分具有發(fā)展前景[11]。隨著FRET技術應用及其研究的不斷深入，必將對現(xiàn)代生命科學研究的發(fā)展起著重大的推動作用。