Cd脅迫下蘆葦體內(nèi)氯化鈉提取態(tài)鎘及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性研究

丁振華，蘇芳莉,2①，孫 權(quán)

1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)水利學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.遼寧雙臺河口濕地生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站，遼寧 盤錦 124112；3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

重金屬鎘是環(huán)境中的持久性污染物，具有隱蔽性、滯后性、微量致毒性以及強(qiáng)移動性等污染特點(diǎn)[1]，在植物根、莖、葉及果實中的大量累積不僅會影響植物的生長和發(fā)育，而且還會隨著食物鏈進(jìn)入人體，危害人類健康[2-3]。而蘆葦作為重金屬鎘的超富集植物，通過獨(dú)特的生理代謝過程，經(jīng)過溶解、沉淀、凝聚、絡(luò)合、吸附等反應(yīng)，可以將鎘以不同離子形態(tài)賦存積累[4-5]，從而減少鎘對植物毒害作用并提高植物耐受性。當(dāng)鎘與蛋白質(zhì)結(jié)合形成螯合物時，可限制鎘在植物體內(nèi)的移動性，使鎘不能再移動和釋放，因此鎘在植物體內(nèi)被限制運(yùn)輸?shù)角o葉，絕大部分保留在根部。蘆葦(Phragmitesaustralis)對鎘的吸收與鎘在蘆葦體內(nèi)各部位分配以及鎘與蘆葦體內(nèi)物質(zhì)的結(jié)合形態(tài)等因素有關(guān)[6]。在蘆葦對鎘的富集過程中，谷胱甘肽起到十分重要的作用[7]，谷胱甘肽不僅能直接結(jié)合重金屬離子，而且還是植物絡(luò)合素的合成前體。植株體內(nèi)γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)是谷胱甘肽生物合成中的關(guān)鍵酶[2]，決定了谷胱甘肽生物合成的速率和數(shù)量，對蘆葦富集積累重金屬鎘的能力具有巨大影響。

作為鎘的超富集植物，蘆葦是遼河濕地的優(yōu)勢物種，對于濕地水質(zhì)凈化，保障遼河口濕地瀕危物種棲息地水質(zhì)質(zhì)量具有重要的生態(tài)作用，蘆葦通過吸收鎘等重金屬，并其保留在蘆葦根中，使?jié)竦氐闹亟饘俚玫焦潭?，減小對周邊動植物及環(huán)境的威脅。為探究鎘脅迫下蘆葦對氯化鈉提取態(tài)鎘(SCd)的富集規(guī)律及螯合吸附鎘過程中γ-GCS對重金屬鎘脅迫的反應(yīng)，通過不同濃度鎘溶液對蘆葦進(jìn)行脅迫培養(yǎng)，分析蘆葦根莖葉中SCd的含量特征和γ-GCS活性變化，揭示蘆葦對鎘的富集規(guī)律，為遼河口濕地有效凈化重金屬污染選育優(yōu)良的蘆葦品種，提高河口區(qū)重金屬污染的凈化效率提供理論依據(jù)，為保護(hù)遼河口濕地生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定及瀕危物質(zhì)棲息地安全提供保障。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗于2016年4—11月在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)水利綜合試驗場內(nèi)進(jìn)行。將蘆葦種植于白塑料桶(直徑40 cm，高40 cm)中，每個生長期選擇生長狀況基本一致的植株進(jìn)行取樣。試驗共設(shè)置6組，第1～5組分別灌溉不同濃度CdCl2溶液(0.5、1.0、2.0、3.0和50 mmol·L-1)進(jìn)行培養(yǎng)，每個濃度設(shè)計5桶蘆葦同時灌溉，分別用于蘆葦5個生長時期的樣品采集，第6組為全生長期清水灌溉培養(yǎng)。每個處理3個重復(fù)，以清水灌溉和CdCl2溶液灌溉做對照，共布設(shè)90桶。

按照《主要作物生育時期劃分及觀測標(biāo)準(zhǔn)》中劃分作物生育階段的標(biāo)準(zhǔn)，將蘆葦整個生長期劃分為發(fā)芽期、展葉期、拔節(jié)期、抽穗期和成熟期5個階段。其中，發(fā)芽期為4月末—5月中旬；展葉期為5月中旬—6月下旬；快速生長期為7月上旬—8月中旬；抽穗期為8月中旬—9月上中旬；成熟期為9月中旬—10月上中旬。

1.2 試驗材料及裝置

供試植物蘆葦于2015年4月采自遼寧遼河口國家級自然保護(hù)區(qū)試驗區(qū)。挖取帶有健康芽眼且未萌發(fā)的蘆葦根狀莖，每段截成約20 cm，將根外部包適量土壤，裝入麻袋，灑適量清水以保證根系濕潤，運(yùn)回試驗地，立即移栽試驗池的土壤中，定時澆水以保證成活。經(jīng)1 a無污染培養(yǎng)后移栽到沙基培養(yǎng)塑料桶(直徑40 cm、高40 cm)中。

1.3 鎘溶液配置及灌溉

在每個生長期取樣前一周，將分析純氯化鎘配置的濃度為0.5、1.0、2.0、3.0和5.0 mmol·L-1的CdCl2溶液分別灌入蘆葦桶內(nèi)，每桶均灌入10 L溶液，剩余由清水灌溉補(bǔ)充保持土面以上5 m水層以保障蘆葦正常生長。以全生長期灌溉清水的蘆葦和5個生長期均灌入鎘溶液的蘆葦作為對照。鎘溶液灌入7 d后，于當(dāng)天13：00—16：00取樣并做好試驗前的樣品處理。

1.4 樣品采集及處理方法

(1)取樣方法：選擇長勢相近的3株植株，小心截取蘆葦莖葉并挖出地下根部，用蒸餾水沖洗干凈，吸水紙吸干表面水分，放入自封袋中保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)Cd含量的測定：蘆葦總鎘含量測定采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(iCAP-7000)測定；蘆葦鎘形態(tài)及含量測定采取分級萃取法，分別稱取2.00 g蘆葦根、莖和葉片新鮮樣品，剪成1～2 mm2的碎片，置于燒杯中，加入37.5 mL提取劑，在30 ℃恒溫箱中放置過夜(17～18 h)，次日回收提取液，再加入同樣體積該提取液，浸取2 h后再回收提取液，重復(fù)2次，即在24 h內(nèi)提取4次，集4次提取液(共150 mL)于燒杯中，消煮測定。樣品消煮后用φ=10%硝酸定容，采用原子吸收分光光度計測定。

(3)γ-GCS活性的測定：選取蘆葦健康植株，沒有變色，沒有蟲咬、沒有水漬變壞的新生根莖葉部位，準(zhǔn)確稱取0.1 g放入研缽中，液氮快速研磨至粉碎，加入磷酸緩沖液，充分振蕩后，離心提取上清液，使用ELISA試劑盒測定酶活性。酶活性單位定義為：在特定的條件下，1 min能轉(zhuǎn)化1 μmoL底物的酶量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

對蘆葦根莖葉中的氯化鈉提取態(tài)鎘的含量采用Excel 2013 和SPSS 19.0軟件對每個生長期的蘆葦根部的鎘含量進(jìn)行單因素方差分析和多重比較，并對鎘溶液濃度與蘆葦根莖葉中γ-GCS活性間的關(guān)系進(jìn)行回歸分析。

對蘆葦γ-GCS活性基于邏輯斯特曲線進(jìn)行分析，即：

(1)

式(1)中,Y為γ-GCS活性，U·mL-1；r為蘆葦γ-GCS活性的內(nèi)稟增長率，即γ-GCS活性最大增長速率，%；k為環(huán)境容納量，即環(huán)境條件所能容許的γ-GCS最大活性，U·mL-1；t為生長時間，d；A為與初始條件有關(guān)的常數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆葦根莖葉中氯化鈉提取態(tài)鎘(SCd)含量

如圖1所示，鎘溶液灌溉條件下蘆葦根內(nèi)SCd的單位積累量變化明顯，各濃度間差異顯著，且均與對照存在極顯著差異(P<0.01)。在同一生長期內(nèi)，不同濃度鎘溶液灌溉下蘆葦根內(nèi)SCd的單位積累量會隨著鎘濃度的變大而增加，除5.0 mmol·L-1條件下之外，各生長期均表現(xiàn)為3.0 mmol·L-1鎘溶液灌溉條件下SCd單位積累量最大，是2.0 mmol·L-1條件下的1.3～1.8倍，是1.0 mmol·L-1條件下的2～4倍，是0.5 mmol·L-1條件下的3～8倍。而隨著蘆葦生長，同一濃度灌溉條件下蘆葦根內(nèi)SCd的單位積累量也會逐漸增加。其中5.0 mmol·L-1鎘溶液灌溉條件下根內(nèi)SCd的單位積累量在展葉期增加迅速，是發(fā)芽期鎘單位積累量的6.1倍，從展葉期到成熟期SCd的單位積累量增加緩慢且在快速生長期之后略低于3.0 mmol·L-1條件下SCd的單位積累量；0～3.0 mmol·L-1鎘濃度灌溉時，SCd的單位積累量在快速生長期之前均呈上升趨勢，濃度越大增長越快，快速生長期之后根中SCd的單位積累量增加緩慢，到成熟期時SCd的單位積累量達(dá)到最大，成熟期時3.0 mmol·L-1條件下根中SCd的單位積累量為3 984.16 mg·kg-1。

鎘溶液灌溉條件下蘆葦莖內(nèi)SCd的單位積累量變化明顯，各濃度間差異顯著，且均與對照存在極顯著差異(P<0.01)。鎘溶液灌溉下蘆葦莖內(nèi)SCd的單位積累量會隨著鎘濃度的提高和蘆葦生長時間的延長而增加。同一生長期內(nèi)，各濃度灌溉條件下蘆葦莖內(nèi) SCd的單位積累量均表現(xiàn)為高濃度大于低濃度，各生長期表現(xiàn)為5.0 mmol·L-1鎘溶液灌溉條件下SCd的單位積累量最大，是3.0 mmol·L-1條件下的1～1.5倍，是2.0 mmol·L-1條件下的1.3～2.0倍，是1.0 mmol·L-1條件下的1.5～3.0倍，是0.5 mmol·L-1條件下的3～5倍。同一濃度灌溉條件下，蘆葦莖內(nèi)SCd的單位積累量從大到小均表現(xiàn)為成熟期>抽穗期>快速生長期>展葉期>發(fā)芽期；不同濃度條件下蘆葦莖內(nèi)SCd的單位積累量的增長速度也隨濃度的提高而增加，即灌溉濃度越大SCd的單位積累量增加越快；在蘆葦生長到快速生長期之后，莖內(nèi)SCd的單位積累量增長速度開始變緩，成熟期時蘆葦莖內(nèi)SCd的單位積累量與快速生長期相比增加極少。

圖1 蘆葦根莖葉中氯化鈉提取態(tài)鎘(SCd)含量Fig.1 The content of sodiumchloride-extraction cadmium (SCd) in Phragmites australis

鎘溶液灌溉條件下蘆葦葉內(nèi)SCd的單位積累量變化明顯，各濃度間差異顯著，且均與對照存在極顯著差異(P<0.01)。在同一生長期內(nèi)，不同濃度鎘溶液灌溉下蘆葦葉內(nèi)SCd的單位積累量會隨著鎘濃度的變大而增加，除5.0 mmol·L-1條件下之外，各生長期均表現(xiàn)為3.0 mmol·L-1鎘溶液灌溉條件下SCd的單位積累量最大，是2.0 mmol·L-1條件下的1～1.5倍，是1.0 mmol·L-1條件下的1.5～2.5倍，是0.5 mmol·L-1條件下的3～6倍。而隨著蘆葦生長，同一濃度灌溉條件下蘆葦葉內(nèi)SCd的單位積累量也會逐漸增加。其中5.0 mmol·L-1鎘溶液灌溉條件下葉內(nèi)鎘SCd的單位積累量在快速生長期前增加迅速，從快速生長期到成熟期SCd的單位積累量則增加緩慢，而且在快速生長期之后就低于3.0 mmol·L-1條件下SCd的單位積累量，在成熟期甚至低于2.0 mmol·L-1條件下SCd的單位積累量。0～3.0 mmol·L-1鎘濃度灌溉時，SCd的單位積累量在抽穗期之前均呈上升趨勢，濃度越大增長越快，快速生長期之后葉中SCd的單位積累量增加緩慢，到成熟期時達(dá)最大，成熟期時3.0 mmol·L-1條件下葉中SCd的單位積累量為824.19 mg·kg-1。

2.2 蘆葦根莖葉中氯化鈉形態(tài)鎘積累量所占比例

由圖2可知，在不同濃度鎘溶液灌溉條件下，各生長期蘆葦根部SCd的積累量均大于莖部和葉部。成熟期時，根部最大積累量為3 984.16 mg·kg-1，是莖部的7.33倍、葉部的4.83倍。

圖2 蘆葦各部位氯化鈉提取態(tài)鎘(SCd)所占比例Fig.2 The content of cadmium (SCd) in Phragmites australis

蘆葦根部SCd積累量的共同特征是： SCd的積累量占各種形態(tài)鎘總積累量的比例隨著生長期的變化微小，隨濃度升高的變化明顯。各濃度灌溉條件下，5.0 mmol·L-1灌溉組中SCd的積累量所占總鎘的比例最高，成熟期時達(dá)57.15%，其次為3.0 mmol·L-1灌溉組，成熟期時所占比例為54.69%；0.5 mmol·L-1灌溉組中SCd的積累量所占總鎘的比例最低，成熟期時為46.64%。蘆葦莖部SCd積累量所占總鎘的比例隨灌溉濃度和生長期的變化無明顯特征，均在40%浮動；蘆葦葉部SCd積累量所占總鎘的比例隨灌溉濃度和生長期的變化亦無明顯特征，均在43%上下浮動。

2.3 蘆葦根莖葉中γ-GCS活性的變化特征

蘆葦根莖葉中γ-GCS活性的變化特征如圖3所示。

圖3 蘆葦根莖葉中γ-GCS活性Fig.3 The γ-GCS Activities in Phragmites australis

在不同濃度鎘溶液灌溉條件下，蘆葦根莖葉中γ-GCS活性均有明顯增加。除成熟期外，在各個生長期中，蘆葦根莖葉中γ-GCS活性均會隨著灌溉濃度升高而增加，且均在5.0 mmol·L-1灌溉條件出現(xiàn)活性最大值；同一濃度灌溉條件下，蘆葦根莖葉中γ-GCS活性則會隨著蘆葦生長而呈先增高后降低的趨勢，其中根中γ-GCS活性在快速生長期出現(xiàn)最大值，5.0 mmol·L-1灌溉條件下根中γ-GCS活性為對照組的5.8倍；莖中γ-GCS活性在展葉期出現(xiàn)最大值，5.0 mmol·L-1灌溉條件下莖中γ-GCS活性為對照組的4.2倍；葉中γ-GCS活性在抽穗期出現(xiàn)最大值，γ-GCS活性為對照組的3.5倍。

2.4 蘆葦對γ-GCS活性的動力學(xué)分析

因清水灌溉下蘆葦γ-GCS活性差異不顯著，故僅對鎘溶液灌溉下蘆葦γ-GCS活性基于邏輯斯特曲線做回歸分析，結(jié)果見表1。

表1 不同鎘濃度下γ-GCS活性的回歸方程及變化參數(shù)Table 1 Regression equation and variation parameters of γ-GCS activity under different cadmium concentrations

從表1可知，不同濃度鎘溶液灌溉條件下蘆葦γ-GCS活性的內(nèi)稟增長率(r值)變化不大，因此可將r值看作是一個不受鎘濃度影響的常數(shù)，而不同濃度鎘溶液灌溉對于蘆葦γ-GCS活性的環(huán)境容納量影響則較大，鎘濃度越高，蘆葦γ-GCS活性的容納量越高。

3 討論

植物遭受重金屬脅迫時會通過自身調(diào)節(jié)來減少金屬對自身生長的影響[8-10]。進(jìn)入蘆葦體內(nèi)的鎘對蛋白質(zhì)或其他有機(jī)化合物中的巰基有很強(qiáng)的親合力，在作物體內(nèi)鎘常與蛋白質(zhì)結(jié)合[11-12]，這種結(jié)合形態(tài)既會減少以自由態(tài)存在的鎘離子，使其有效性和移動性降低；但其與體內(nèi)功能蛋白相結(jié)合，對蛋白功能發(fā)生干擾，造成植物生理、生化代謝過程紊亂[13]。ANTONOVICS等[14]研究發(fā)現(xiàn)，與植物中蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)的鎘常以SCd形式存在。楊居榮等[11]通過對冬小麥、旱稻等8種作物的篩選研究發(fā)現(xiàn)，8種作物體內(nèi)以SCd形式結(jié)合的鎘含量均占很大比例；在香菇和大豆中亦是SCd形式為主[15]。筆者研究結(jié)果表明蘆葦在受到Cd脅迫時，進(jìn)入蘆葦體內(nèi)的絕大部分Cd被富集在根部，而遷移至其他部位的較少，而在蘆葦不同部位內(nèi)均以NaCl提取態(tài)占絕對優(yōu)勢，這一結(jié)果與YE等[16]和江行玉等[17]的結(jié)論一致。灌溉鎘濃度增加時，蘆葦植株根、莖、葉的SCd積累量呈先增加后減少的趨勢，同時蘆葦γ-GCS活性也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，表明一定濃度鎘脅迫會促進(jìn)蘆葦對鎘吸收富集，但過量的鎘將會對蘆葦?shù)恼ＩL代謝造成影響[18]。同時，根據(jù)根莖葉部位之間SCd的積累量變化及蘆葦吸收總鎘比例的分析發(fā)現(xiàn)，在Cd脅迫下蘆葦體內(nèi)不同形態(tài)鎘的積累量均有增加，其中SCd的增加最顯著，正是由于這種增加，使得蘆葦富集鎘的總量增加。因此在以蘆葦為主的濕地中，蘆葦富集鎘后主要集中在根部，減少了濕地生產(chǎn)生活中鎘的危害，以保證濕地生態(tài)系中動植物的正常生長。對蘆葦體內(nèi)鎘結(jié)合蛋白的產(chǎn)生及去向以及多年灌溉鎘溶液對蘆葦遺傳物質(zhì)的影響及優(yōu)良蘆葦品種的篩選，仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

通過對不同鎘溶液灌溉脅迫下各個時期蘆葦根莖葉不同部位中各種形態(tài)鎘的總積累量進(jìn)行對比可知，成熟期時根部的總鎘積累量最大，為3 984.16 mg·kg-1，是莖部的7.33倍，葉部的4.83倍。同時，蘆葦根部SCd占總鎘的比例隨灌溉濃度增加小幅度升高，成熟期時5.0 mmol·L-1灌溉下達(dá)到最大，為57.15%；而SCd在蘆葦莖部和葉部中占總鎘的比例隨灌溉濃度和生長期的變化無明顯變化，生長周期內(nèi)莖部SCd約占莖中總鎘含量的40%左右，葉部SCd約占葉中總鎘的43%左右。同時蘆葦各部位γ-GCS活性隨鎘濃度升高呈先升高后降低的趨勢。