護(hù)心康對(duì)TLR4-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型β-catenin的影響

董曉斐，丁小玉，賀佳幸，屈 波

（1．湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2．湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，目前研究表明有很多誘發(fā)因素與之相關(guān)，國內(nèi)外公認(rèn)與血脂代謝紊亂有關(guān)，尤其是高脂血癥的存在[1]。近來研究發(fā)現(xiàn)：Wnt信號(hào)通路與動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病的發(fā)病密切相關(guān)[2]，可能成為控制動(dòng)脈粥樣硬化的新型靶點(diǎn)。TOLL樣受體4（TOLL-like receptor 4，TLR4）激活可以介導(dǎo)AS血管壁炎癥，抑制TLR4是否會(huì)影響Wnt信號(hào)的表達(dá)，目前尚未見報(bào)道。既往研究表明，護(hù)心康對(duì)AS的防治具有較好的療效，本研究通過TLR4-/-小鼠AS模型，觀察Wnt信號(hào)通路中β-catenin的變化及護(hù)心康的干預(yù)作用，探討護(hù)心康防治AS的作用機(jī)制，為AS的治療及臨床用藥提供更多理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

S P F級(jí)T L R 4基因敲除小鼠7 0只，6周齡，（20.3±2.5）g，雄性，購自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，合格證號(hào)：201800971.普通飼料由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，高脂飼料由上海普路騰生物科技有限公司生產(chǎn)提供，動(dòng)物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)過程中，所有研究人員均人道地進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)格遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的各項(xiàng)倫理?xiàng)l例。

1.2 藥物

阿托伐他汀鈣片（輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格20 mg/片，國藥準(zhǔn)字國藥準(zhǔn)字H20051408）。護(hù)心康片（湖南省中醫(yī)研究院附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，批號(hào)為（湘）衛(wèi)藥劑（2003）12第039號(hào)），由瓜蔞皮、薤白、陳皮、遠(yuǎn)志、法半夏、茯苓、蓽澄茄、石菖蒲、旋覆花、隔山消、苦杏仁、茜草、三七、丹參、蒲黃、五靈脂、琥珀、北山楂、葳蕤、黃芪、炙甘草等組成，每片含生藥0.3 g。

1.3 主要試劑與儀器

膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯檢測試劑盒及檢測儀器cobas8000全自動(dòng)生化分析儀由羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司提供；β-catenin兔抗小鼠單克隆抗體、PV-6002羊抗小鼠IgG/HRP聚合物由美國GBI公司提供；WIF由美國R&D公司提供；Olympus BX-51光學(xué)顯微鏡及數(shù)碼攝影系統(tǒng)由日本奧林帕斯公司生產(chǎn)。

1.4 模型建立及處理

SPF級(jí)TLR4-/-小鼠共70只，雌雄各半，隨機(jī)取12只為正常對(duì)照組，予以普通飼料喂養(yǎng)；其余58只予以高脂飼料喂養(yǎng)13周，飼料含脂肪21%，膽固醇0.15%[3]。13周后隨機(jī)抽取5只解剖觀察胸主動(dòng)脈，光鏡下發(fā)現(xiàn)斑塊為造模成功；造模過程中死亡5只小鼠。造模成功的動(dòng)物隨機(jī)分為模型組、護(hù)心康組、阿托伐他汀組、Wnt抑制劑WIF組，每組12只，分別予以相應(yīng)處理。正常組不做處理，其余各組均予灌胃和腹腔注射處理，灌胃容積均為0.5 mL、腹腔注射容積均為0.3 mL，1次/d。模型組予以生理鹽水灌胃并腹腔注射；護(hù)心康組按動(dòng)物與人體間的等效換算法，按生藥劑量21.6 g/kg·d灌胃，腹腔注射生理鹽水；阿托伐他汀組按3 mg/（kg·d）灌胃，腹腔注射生理鹽水；Wnt抑制劑WIF用量為2 ug，生理鹽水稀釋后腹腔注射，生理鹽水灌胃，上述處理時(shí)間均為8周。

1.5 觀察指標(biāo)

于第21周末，3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，進(jìn)行心臟采血，使用酶比色法檢測血脂，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。然后打開小鼠胸廓充分顯露心臟，將主動(dòng)脈分離出來，取胸主動(dòng)脈固定于4%的多聚甲醛中，取小鼠主動(dòng)脈血管，乙醇脫水及二甲苯透明后石蠟包埋切片，常規(guī)脫臘脫水后進(jìn)行HE染色，光鏡下進(jìn)行病理學(xué)觀察。免疫組織化學(xué)法測定β-cateninn，以標(biāo)本出現(xiàn)棕黃色為陽性顯色；OlympusBX-51光學(xué)顯微鏡400 倍觀察切片，應(yīng)用Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行光密度分析，每張切片分析5個(gè)連續(xù)的視野， 取其均值為該標(biāo)本測量結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以“±s”表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD和Dunnet檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血脂檢測

造模后動(dòng)物的血脂水平比正常組明顯升高（P＜0.05），其中高密度脂蛋白的升高考慮是機(jī)體受到膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白的刺激后產(chǎn)生的應(yīng)激性增高，屬于保護(hù)性；阿托伐他汀和護(hù)心康對(duì)膽固醇和低密度脂蛋白的升高具有明顯的療效（P＜0.05），WIF的對(duì)其的降低作用不明顯；三種藥物對(duì)甘油三酯和高密度脂蛋白的影響相對(duì)較小，見表1。

表1 各組血脂檢測（±s，mmol/l）

表1 各組血脂檢測（±s，mmol/l）

注： 與正常組相比aP＜0.05，與模型組相比bP＜0.05；與他汀組相比cP＜0.05

組別 n 膽固醇 甘油三酯 低密度脂蛋白 高密度脂蛋白正常組 12 1.85±0.23 1.21±0.25 0.45±0.37 1.42±0.35模型組 12 3.21±0.50a 2.52±0.45a 0.92±0.26a 2.64±0.41a阿托伐他汀組 12 1.83±0.37b 1.68±0.40 0.36±0.19b 1.80±0.34 WIF組 12 2.97±0.28c 1.74±0.25 0.73±0.20a 1.96±0.23護(hù)心康組 12 2.01±0.36b 1.81±0.52 0.43±0.28b 1.83±0.29

2.2 病理學(xué)觀察

造模過程中小鼠死亡5只。21周后觀察光鏡胸主動(dòng)脈。正常組無斑塊形成，主動(dòng)脈管壁分層清楚，內(nèi)膜平整光滑，內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊，平滑肌細(xì)胞走形良好。模型組動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增厚，大量斑塊形成，血管腔明顯減小，表明造模成功。各藥物干預(yù)組亦內(nèi)膜均有不同程度增厚，伴有粥樣斑塊形成，但斑塊病變減輕，斑塊面積變小，泡沫細(xì)胞減少，見圖1。

2.3 β-catenin蛋白的表達(dá)

細(xì)胞胞漿可見的棕黃色顆粒為β-catenin蛋白的陽性表達(dá)，棕黃色顆粒越多，表達(dá)越明顯。高脂造模后，模型組中β-catenin蛋白表達(dá)明顯高于正常組（P＜0.01）；與模型組相比，三種藥物均能降低β-catenin ，Wnt抑制劑WIF降低作用較強(qiáng)（P＜0.01），護(hù)心康組和阿托伐他汀組也有明顯的降低作用（P＜0.05）；WIF降低β-catenin的作用較阿托伐他汀強(qiáng)（P＜0.05），圖2、表2。

圖1 各組病理學(xué)改變（HE染色，×100）

圖2 各組β-catenin的表達(dá)（HE染色，×400）

表2 免疫組化檢測β-catenin蛋白表達(dá)（±s）

表2 免疫組化檢測β-catenin蛋白表達(dá)（±s）

注： 與正常組相比aP＜0.01；與模型組相比bP＜0.05；cP＜0.01；與阿托伐他汀組相比dP＜0.05

組別 n β-catenin正常組 12 15.13±4.54模型組 12 40.27±5.16a阿托伐他汀組 12 35.52±4.60ab WIF組 12 31.30±5.63abcd護(hù)心康組 12 36.67±4.71ab

3 討 論

實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與高血脂有密切關(guān)系，高血脂可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，脂質(zhì)沉積，同時(shí)誘發(fā)單核細(xì)胞浸潤血管壁，，吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，誘發(fā)慢性血管炎癥，導(dǎo)致血管壁增厚，管腔狹窄。Wnt是由19個(gè)蛋白分子構(gòu)成的分泌蛋白家族，通過分泌蛋白與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，激活相應(yīng)的基因表達(dá)，從而影響細(xì)胞粘附和炎癥因子的釋放等生理病理過程。Wnt信號(hào)通路分為經(jīng)典和非經(jīng)典兩大類，Wnt/β-catenin信號(hào)通路屬于經(jīng)典型通路，居于Wnt通路中研究之首。Wnt與其受體卷曲蛋白或低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白結(jié)合，通過一系列反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)β-catenin增多，進(jìn)而與T細(xì)胞因子/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子發(fā)生相互作用，激活Wnt信號(hào)通路相關(guān)靶基因，從而影響下游炎癥反應(yīng)和細(xì)胞粘附[4]。β-catenin蛋白屬于Wnt /β-catenin 通路的上游因子，表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞中。研究表明：動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中β-catenin的基因和蛋白表達(dá)明顯升高，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路參與了AS的形成[5]。激活血管內(nèi)皮細(xì)胞的Wnt/β-catenin信號(hào)通路，可以導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，單核細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附性增強(qiáng)，使單核細(xì)胞易于和內(nèi)皮粘附，從而誘發(fā)血管壁炎癥[6]。β-catenin也可激活Wnt/β-catenin通路，進(jìn)而導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的表達(dá)釋放，表明Wnt/β-catenin通路在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用[7]。激活Wnt信號(hào)通路可導(dǎo)致脂代謝紊亂，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，說明其與高血脂有密切關(guān)系[8]。以上研究都提示：Wnt信號(hào)通路與動(dòng)脈粥樣硬化形成的多個(gè)環(huán)節(jié)有關(guān)，尤其是高血脂和炎癥反應(yīng)有關(guān)，主要作用靶點(diǎn)為內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，動(dòng)脈粥樣硬化的主要病理基礎(chǔ)是痰濁和瘀血，因此治療中常常貫徹活血化瘀和祛痰消濁。護(hù)心康主要具有消痰散結(jié)和活血行瘀的作用，在臨床冠心病的治療中取得了較好的療效。研究發(fā)現(xiàn)：護(hù)心康對(duì)痰瘀阻絡(luò)型冠心病具有較好的療效，能有效改善心絞痛的發(fā)作癥狀和心電圖表現(xiàn)[9]；同時(shí)提高患者的生存質(zhì)量[10]。護(hù)心康可以降低冠心病患者血清超敏C反應(yīng)蛋白和sICAM-1水平[11]，血清超敏C反應(yīng)蛋白是判斷炎癥的靈敏指標(biāo)，其表達(dá)下降可以降低單核細(xì)胞分泌炎癥因子；血清sICAM-1含量降低可以減少炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的細(xì)胞黏附，護(hù)心康通過降低二者的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，延緩冠心病的發(fā)生發(fā)展。

我們前期以兔動(dòng)脈粥樣硬化為模型的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)護(hù)心康能有效降低血脂[12]，抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中TLR4、TNF-α的表達(dá)[13-14]，并抑制內(nèi)皮細(xì)胞MyD88 和TRAF6基因的表達(dá)[15]，這些作用共同合力可以起到延緩血管壁炎癥的作用。敲除TLR4基因?qū)?dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展有和影響呢？本實(shí)驗(yàn)研究顯示：高脂飼料喂養(yǎng)的TLR4-/-小鼠，血脂水平明顯升高；光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜增厚，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，血管腔狹窄；說明單純抑制TLR4并不能杜絕高脂誘發(fā)的動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生，即動(dòng)脈粥樣硬化是由多因素共同作用而成，單一靶點(diǎn)的處理很難起到一錘定音的效果。免疫組化測定模型組中β-catenin的表達(dá)水平較正常組明顯增高，進(jìn)一步證實(shí)動(dòng)脈粥樣硬化與Wnt信號(hào)通路存在緊密聯(lián)系。分別采用降血脂藥物阿托伐他汀、Wnt抑制劑WIF及中藥復(fù)方護(hù)心康對(duì)AS模型進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示三種藥物均能抑制β-catenin，其中Wnt抑制劑組降低β-catenin的作用較阿托伐他汀和護(hù)心康強(qiáng)，其中護(hù)心康和阿伐他汀可以明顯降低血膽固醇和低密度脂蛋白。我們推測，護(hù)心康可能通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，減弱下游的炎癥反應(yīng)，從而起到抑制動(dòng)脈粥樣硬化的作用。