噬菌體治療細(xì)菌性疾病的研究進(jìn)展及發(fā)展方向

鄒秀月，蔡德周

(大理護(hù)理職業(yè)學(xué)院微生物學(xué)教研室，云南 大理 671000)

噬菌體是寄生細(xì)菌、放線菌、真菌等微生物體內(nèi)的病毒。噬菌體與宿主菌之間具有嚴(yán)格的特異性，其特異性取決于噬菌體吸附器官和受體菌表面受體的分子結(jié)構(gòu)和互補(bǔ)性。噬菌體只有在活菌內(nèi)才能增殖，在病毒中分布廣泛，通常有細(xì)菌存在的地方就可以找到噬菌體。

從2009年12月開始，國際學(xué)者相繼在世界各地發(fā)現(xiàn)一種攜帶NDM-1耐藥基因的新型“超級(jí)細(xì)菌”，這種細(xì)菌能夠?qū)θ蛏鲜械慕?00種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性[1]。2010年10月中國疾病預(yù)防控制中心和中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院宣布中國寧夏和福建兩省發(fā)現(xiàn)攜帶有“超級(jí)細(xì)菌”的3例病例[2]。美國每年有200多萬例耐藥菌感染患者，直接導(dǎo)致23 000例患者死亡[3]。在日本，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的檢出率>30%[4]。據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心的調(diào)查研究[5]顯示：多年來我國抗菌藥物臨床用量高居各類藥物之首，每年有20萬例死于藥物不良反應(yīng)，其中因抗菌藥物濫用導(dǎo)致的死亡占40%。奧尼爾委員會(huì)(O’Neil commission)對(duì)消除抗菌藥物耐藥性全球威脅的手段進(jìn)行了評(píng)估，預(yù)計(jì)至2050年，全球?qū)⒂? 000萬例患者死于耐藥菌感染[3]。耐藥菌株越來越多，耐藥性越來越強(qiáng)，在這樣的醫(yī)療環(huán)境中，研究新的抗菌藥物及治療方案來對(duì)抗耐藥菌感染已成為全球亟待解決的問題。在G20杭州峰會(huì)上，抗菌藥物耐藥性問題已被提上議程。因噬菌體具有特殊的生物活性和強(qiáng)大的抗菌功能，重新進(jìn)入了科學(xué)家的視野，科學(xué)家也開展了廣泛的試驗(yàn)研究和臨床實(shí)踐。2014、2016年第一屆和第二屆噬菌體國際學(xué)術(shù)研討會(huì)相繼在南京、武漢召開，標(biāo)志著全球開始重視噬菌體臨床治療。

1 噬菌體的特性

噬菌體分為毒性噬菌體和溫和噬菌體兩類。能在宿主菌體內(nèi)增殖并導(dǎo)致宿主菌死亡的噬菌體稱為毒性噬菌體。毒性噬菌體復(fù)制產(chǎn)生子代噬菌體，當(dāng)子代噬菌體達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，由于噬菌體合成酶類的溶解，菌體細(xì)胞裂解，釋放出的噬菌體再感染其他敏感細(xì)菌，再度裂解細(xì)菌。溫和噬菌體是指感染宿主菌后并不增殖，其基因整合于細(xì)菌染色體上即前噬菌體，隨細(xì)菌染色體的復(fù)制而復(fù)制，并隨細(xì)菌分裂而分配至子代細(xì)菌的染色體中。帶有前噬菌體基因組的細(xì)菌稱為溶原性細(xì)菌，溫和噬菌體也可偶爾自發(fā)地或在某些理化或生物因素的影響下，將整合的前噬菌體脫離宿主菌染色體，進(jìn)入溶菌性周期導(dǎo)致細(xì)菌裂解，并產(chǎn)生新的成熟噬菌體。

2 噬菌體治療技術(shù)的優(yōu)勢

噬菌體是自然的產(chǎn)物，是微生物食物鏈中的一個(gè)環(huán)節(jié)。噬菌體可以侵染細(xì)菌，利用細(xì)菌新陳代謝自我復(fù)制，對(duì)細(xì)菌具有天然的裂解能力和與生俱來的適應(yīng)優(yōu)勢，這種噬菌體的裂解能力不受細(xì)菌耐藥性和生存環(huán)境的影響，是大自然一物降一物的杰作，使用噬菌體作為抗菌劑，符合自然規(guī)律和叢林法則。

抗菌藥物不易突破血腦屏障進(jìn)入腦組織，噬菌體感染小鼠腦部并能原位增殖說明噬菌體可通過血腦屏障[6]?？咕幬锏膹V譜抗菌性，既能殺滅敏感的致病菌又能殺滅非致病菌，還能引起非敏感菌發(fā)生耐藥變異。長期使用將導(dǎo)致人體正常菌群紊亂，出現(xiàn)菌群失調(diào)，甚至導(dǎo)致機(jī)會(huì)感染。噬菌體特異性強(qiáng)，其特異性由噬菌體和菌體本身決定。一種噬菌體只侵染相應(yīng)的細(xì)菌，并在細(xì)菌感染部位裂解該細(xì)菌，不會(huì)擴(kuò)散，隨著宿主菌的裂解而死亡，不會(huì)單獨(dú)留存在體內(nèi)，更不會(huì)繁殖。而且對(duì)哺乳類動(dòng)物細(xì)胞無任何影響，不會(huì)影響人體的正常菌群。如果抗菌藥物對(duì)患者治療無效，那么噬菌體制劑替代抗菌藥物可能會(huì)有較好的治療效果[7]。

噬菌體在宿主菌體內(nèi)繁殖速度快，在短時(shí)間內(nèi)能復(fù)制出許多子代噬菌體。每個(gè)子代噬菌體與親代噬菌體具有相同的侵染、復(fù)制能力，通過多代增殖，少量噬菌體就可殺滅許多細(xì)菌。一次給藥，連續(xù)有效，直至消滅全部細(xì)菌[8]。噬菌體還可根據(jù)宿主菌的分裂速度調(diào)整復(fù)制速度和裂解能力，動(dòng)態(tài)適應(yīng)宿主菌?？咕幬锶舨荒軞⑺兰?xì)菌，將使細(xì)菌的耐藥性越來越嚴(yán)重。試驗(yàn)證明細(xì)菌對(duì)噬菌體產(chǎn)生對(duì)抗的突變頻率為10-7，而細(xì)菌對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生對(duì)抗的突變頻率為10-5[9]，因此，對(duì)于那些多重耐藥菌、泛耐藥菌甚至“超級(jí)細(xì)菌”感染，抗菌藥物的選擇非常有限，甚至無藥可選，在這種情況下，噬菌體治療將大有用武之地。

噬菌體存在自然界的各個(gè)角落，包括河水、土壤、污水中都存在?？梢哉f，凡是有細(xì)菌的場所，就有相應(yīng)噬菌體的存在，在健康人體的正常菌群中也廣泛存在[10]。在微生物生態(tài)環(huán)境中，噬菌體是細(xì)菌的克星，能殺死細(xì)菌并伴隨細(xì)菌的存在而存在，死亡而死亡。在人類尋找抗菌藥物、治療細(xì)菌性感染疾病中，噬菌體容易獲取，是取之不盡的自然資源[11]。篩選裂解耐藥菌株新噬菌體的周期短，有時(shí)僅需幾周或幾個(gè)月的時(shí)間。通過人工培養(yǎng)細(xì)菌、過濾除菌、純化噬菌體、制備高效價(jià)噬菌體即可獲得[12]。研發(fā)成本較低，制劑常溫保存即可。而開發(fā)一種新抗菌藥物則可能需要幾年甚至十幾年。Spellberg 等[13]對(duì)全球最大的15家跨國制藥公司調(diào)查后獲悉：目前只有5種抗菌藥物制劑處于研發(fā)階段。細(xì)菌耐藥變異發(fā)生的速度遠(yuǎn)超過人類研發(fā)出新型抗菌藥物的速度，研究生產(chǎn)全新抗菌藥物勢在必行。

3 噬菌體臨床治療歷程

1915年英國科學(xué)家Edward Twort發(fā)現(xiàn)了噬菌體(bacteriophage)。1919年，加拿大科學(xué)家Felix D’Herelle用噬菌體制劑對(duì)4例細(xì)菌性痢疾患者進(jìn)行治療，獲得成功。第一次證實(shí)噬菌體可作為藥物裂解細(xì)菌[14]。1921年Bruynoghe等最先使用噬菌體制劑治療皮膚葡萄球菌化膿性感染，病情在2 d內(nèi)有所好轉(zhuǎn)[14]。1931年，D’Herelle和DEliava在印度初次使用噬菌體治療消化道烈性傳染病霍亂，噬菌體治療試驗(yàn)組的病死率為6.8%，而對(duì)照組的病死率為62.7%[14]。二十世紀(jì)三十年代美國制藥公司開始銷售以噬菌體為基本成分的治療藥物。二十世紀(jì)六十年代，葡萄球菌噬菌體的溶菌液(SPL)被許可用于治療人類疾病[15]，應(yīng)用噬菌體治療抗菌藥物治療失敗的600多例患者，80%的患者被治愈。治療過程中患者未出現(xiàn)副作用。第二次世界大戰(zhàn)期間德國和蘇聯(lián)軍隊(duì)用噬菌體治療腹瀉，取得很好效果。

進(jìn)入二十世紀(jì)七十年代末期，Eliava研究中心使用葡萄球菌噬菌體制劑用于局部治療，效果顯著。僅采用噬菌體治療的膿毒癥患者中有41%的患者痊愈，采用噬菌體與抗菌藥物聯(lián)合使用治療的膿毒癥患者中有78%的患者被徹底治愈，而僅用抗菌藥物治療的膿毒癥患者中治愈率僅為23%。2009年英國皇家耳鼻喉?？漆t(yī)院對(duì)噬菌體治療Ⅰ期和Ⅱ期慢性耳炎進(jìn)行臨床研究[16]，安全性及效果均較好。噬菌體蛋白鼻腔噴霧劑還能有效預(yù)防中耳感染[17]。Weber-Dabrowska B等使用噬菌體治療腫瘤患者20例和細(xì)菌感染者27例，發(fā)現(xiàn)所有患者的肺炎及化膿性創(chuàng)傷感染等并發(fā)癥明顯好轉(zhuǎn)[18]。噬菌體可激活免疫應(yīng)答，促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌，提高免疫。

噬菌體藥物在前蘇聯(lián)、波蘭及其他國家的醫(yī)院一直在廣泛使用，噬菌體雞尾酒療法已被成功應(yīng)用數(shù)十年，普通藥店已有噬菌體藥物出售，包括噴霧劑、粉末劑、傷口貼、液體制劑等，有效的治療了傷口細(xì)菌感染。美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)使用噬菌體對(duì)多種細(xì)菌感染引起的下肢靜脈性潰瘍進(jìn)行臨床試驗(yàn)，治療效果好又安全[19]?；撔阅X膜炎和癤病治愈率甚至達(dá)到了100%。2016年，美國加利福利亞大學(xué)教授Thomas Patterson感染多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌而處于昏迷，使用鮑曼不動(dòng)桿菌敏感的噬菌體雞尾酒及工程噬菌體治療，完全被治愈，轟動(dòng)一時(shí)。

早在1958年，我國第一位細(xì)菌學(xué)博士余賀教授就利用噬菌體成功治療了1例銅綠假單胞菌感染的燒傷患者。抗美援朝時(shí)期，由于抗菌藥物極度匱乏，我國戰(zhàn)地醫(yī)院也曾利用噬菌體治療戰(zhàn)傷。據(jù)李宏鳴等[20]報(bào)道，3例確診為結(jié)核性口腔潰瘍患者涂抹分枝桿菌噬菌體軟膏后，在1周內(nèi)開始好轉(zhuǎn)，半年后復(fù)查已完全恢復(fù)。成都生物制品研究所研究人員使用國內(nèi)自行研制的多價(jià)痢疾噬菌體治療23例痢疾患者，總有效率達(dá)95.66%。解放軍第175醫(yī)院的一項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)，將22例痢疾患者分為兩組，分別用多價(jià)噬菌體和黃連素治療，發(fā)現(xiàn)兩組之間的治愈率差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而噬菌體治療組的復(fù)發(fā)率較黃連素組低。

2012年的噬菌體治療回顧性研究[21]表明，153例各種感染性疾病患者曾接受噬菌體治療，40%的患者獲得滿意的治療效果(根除病原菌)，6例患者因不良反應(yīng)而停止治療，其他未發(fā)現(xiàn)安全隱患。目前抗菌噬菌體的研究大多針對(duì)耐藥性細(xì)菌，實(shí)驗(yàn)對(duì)象多為動(dòng)物，治療主要應(yīng)用于局部治療。想要使噬菌體抗菌治療得到廣泛應(yīng)用，需要加快噬菌體在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用研究。

4 噬菌體治療技術(shù)的劣勢

噬菌體伴隨細(xì)菌存在而存在，伴隨細(xì)菌裂解而死亡。噬菌體死亡后，其蛋白質(zhì)成分在細(xì)菌感染部位殘留，這些成分作為抗原物質(zhì)，可激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答產(chǎn)生的抗體可阻止噬菌體吸附于細(xì)菌表面，從而影響噬菌體在細(xì)菌內(nèi)的復(fù)制，會(huì)降低裂解細(xì)菌的能力。此外，機(jī)體的天然免疫也會(huì)將噬菌體清除。

噬菌體攜帶一些毒素基因可能會(huì)給機(jī)體帶來不利影響，噬菌體在感染宿主菌時(shí)，基因組上編碼的遺傳信息在感染細(xì)菌過程中能夠表達(dá)，倘若噬菌體基因組上存在有毒素基因，噬菌體殺死細(xì)菌的同時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生毒素，對(duì)人體有毒害作用，存在安全隱患[22]。在治療感染性疾病時(shí)，敏感的抗菌藥物用得越早，殺菌效果越好。而細(xì)菌內(nèi)的噬菌體只有達(dá)到一定濃度時(shí)才開始增殖。噬菌體接種過早或劑量不當(dāng)時(shí)，可能會(huì)在開始增殖之前就被免疫系統(tǒng)消滅[23]。因此，把握噬菌體的最佳接種時(shí)間和接種方式與劑量將成為實(shí)施噬菌體治療技術(shù)的難點(diǎn)。

噬菌體識(shí)別宿主菌時(shí)的高度特異性，決定了噬菌體的抗菌譜很窄。噬菌體的特異性不是表現(xiàn)在細(xì)菌的種水平，而是表現(xiàn)在型的水平[24]。某一型的噬菌體只能侵染并裂解相應(yīng)型的細(xì)菌，對(duì)其他型的細(xì)菌不起作用，一定程度上限制了噬菌體在臨床上的廣泛應(yīng)用。病原菌種屬多、型多，均需要研究得到相應(yīng)的噬菌體。將多種噬菌體制成混合制劑，應(yīng)用范圍才會(huì)擴(kuò)大。如果將其他國家和地區(qū)研發(fā)的噬菌體產(chǎn)品應(yīng)用于我國耐藥菌的控制，可能并不一定有效。

噬菌體治療技術(shù)幾乎都使用烈性噬菌體，目前因沒有足夠數(shù)量和種類的烈性噬菌體，使噬菌體治療技術(shù)不能在臨床治療中廣泛推行[25]?，F(xiàn)在分離到的噬菌體多針對(duì)革蘭陰性菌，針對(duì)革蘭陽性菌的報(bào)道則比較少。

細(xì)菌與人類有廣泛的相互作用，而噬菌體與人類還沒有直接的關(guān)系。韓晗等[26]認(rèn)為：由于病毒的本質(zhì)，噬菌體常呈現(xiàn)出較為負(fù)面的公眾印象，始終遭受部分學(xué)者質(zhì)疑，甚至日后可能面臨極大的公眾阻力。在治療人類疾病方面，噬菌體還未獲得大部分國家的授權(quán)和許可。在后抗菌藥物時(shí)代，噬菌體療法有望成為治療細(xì)菌感染的未來趨勢，但是受科技發(fā)展水平、法律法規(guī)的監(jiān)管理念以及倫理和生物安全等因素制約，噬菌體治療依然面臨著諸多挑戰(zhàn)。

5 噬菌體治療發(fā)展方向

細(xì)菌遺傳學(xué)的創(chuàng)始人、諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Lederberg博士在美國科學(xué)院院報(bào)(PNAS)的評(píng)論中指出：因耐藥性細(xì)菌的出現(xiàn)，抗菌藥物治療感染性疾病不再像曾經(jīng)的那么有效，應(yīng)該重視噬菌體作為生物抗菌制劑的研究，各國政府必須高瞻遠(yuǎn)矚、未雨綢繆，做好頂層設(shè)計(jì)[27]。

一個(gè)理想的可用于治療的噬菌體應(yīng)具備強(qiáng)大的裂解能力，較好的環(huán)境適應(yīng)性和穩(wěn)定性，基因組上不攜帶毒素基因，具有相對(duì)廣譜的裂解范圍，至少應(yīng)能裂解某個(gè)屬的絕大部分細(xì)菌，易于分離和純化，對(duì)人的免疫系統(tǒng)無負(fù)面影響等。

目前研究噬菌體的單位和學(xué)者逐漸增多，如果將各地區(qū)所有收集的噬菌體信息展示在一個(gè)共享平臺(tái)上，形成一個(gè)噬菌體庫，那么在需要某種噬菌體進(jìn)行治療時(shí)，就可以實(shí)現(xiàn)快速資源共享。這可能是未來應(yīng)對(duì)超級(jí)細(xì)菌或者恐怖襲擊等緊急狀況時(shí)一個(gè)恰當(dāng)?shù)倪x擇，是國家生物安全的一項(xiàng)保障措施[24]。

利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，采用適當(dāng)?shù)幕蚋脑觳呗?，提取噬菌體中細(xì)胞壁裂解酶、噬菌體內(nèi)溶素等有效成份作為抗菌藥物，這樣既可保持噬菌體殺菌活性，又不會(huì)引起免疫反應(yīng)。研究[28]還發(fā)現(xiàn)，這些活性成份與其他抗菌制劑聯(lián)合使用可提高抗菌效果，對(duì)目標(biāo)細(xì)菌產(chǎn)生協(xié)同治療效應(yīng)。鄭旭東等[29]認(rèn)為，活性成分非噬菌體本身的成分，不具有自我復(fù)制或基因整合能力，克服了噬菌體的免疫原性及微生物的耐藥性，排除了對(duì)人類自身構(gòu)成的潛在威脅，極有可能成為全新作用機(jī)制的抗菌藥物。

噬菌體的作用譜比較窄，一定程度上限制了噬菌體在臨床上的應(yīng)用。目前常見的解決方案是用噬菌體雞尾酒制劑來控制不同型別細(xì)菌的感染[30]。雞尾酒制劑內(nèi)包含的噬菌體種類越多，其宿主譜覆蓋度就越大。另外一個(gè)方法是通過對(duì)已有噬菌體的改造，擴(kuò)大其宿主范圍[31]。同時(shí)，利用連續(xù)傳代篩選出變異后能在體內(nèi)長期循環(huán)的噬菌體，該噬菌體一定程度能抵抗機(jī)體免疫系統(tǒng)的清除，可延長在體內(nèi)的生存時(shí)間。

專家提出將噬菌體作為藥物的運(yùn)輸工具，將藥物運(yùn)輸?shù)侥繕?biāo)菌體內(nèi)發(fā)揮殺菌作用。方法一：將抗菌藥物直接連接到噬菌體上，借助噬菌體與宿主菌之間的特異性，將抗菌藥物引導(dǎo)至細(xì)菌感染處，提高抗菌藥物的局部濃度，從而殺滅耐受常規(guī)藥物劑量的目標(biāo)細(xì)菌；方法二：利用生物技術(shù)，依靠噬菌體將外源致死性基因注入細(xì)菌內(nèi)并表達(dá)為殺菌蛋白，由殺菌蛋白直接殺死細(xì)菌[32]。噬菌體作為藥物載體，既能提高細(xì)菌感染部位藥物的濃度，又能提高藥物的利用率，還能作為部分噬菌體殺菌活性不足的補(bǔ)充。因此，最理想的抗菌藥物就是藥物載體噬菌體。

此外，篩選有效的噬菌體劑型，建立科學(xué)的針對(duì)噬菌體制劑的藥學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，純化噬菌體制劑，降低毒素水平，利用噬菌體與白細(xì)胞、抗菌藥物的協(xié)同作用，都是當(dāng)前研究和發(fā)展的方向。

6 噬菌體抗體技術(shù)

免疫血清抗體和雜交瘤抗體都不是人源性抗體，生產(chǎn)量有限，而且有免疫原性。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了噬菌體展示技術(shù)。應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)對(duì)抗體進(jìn)行表達(dá)和克隆，針對(duì)億萬種不同特異性抗體可變區(qū)的基因，組建噬菌體基因文庫，形成噬菌體抗體庫[33]。噬茵體抗體庫實(shí)現(xiàn)了不同特異性抗體的表達(dá)和基因型的統(tǒng)一，把抗原識(shí)別和抗體無限制生產(chǎn)能力結(jié)合在一起，在人源性抗體的獲得和篩選方面突顯其優(yōu)勢[34]。噬茵體抗體庫技術(shù)是迄今發(fā)展最成熟、應(yīng)用最廣泛的抗體制備技術(shù)。