骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體在骨質(zhì)疏松中的研究進(jìn)展

孫珂煥 朱曉峰 楊麗 王攀攀 李小云 張榮華*

1.暨南大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510632 2.暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510632 3.暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510630 4.暨南大學(xué)腫瘤研究所，廣東 廣州 510632

隨著人口老齡化的加速，骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)的發(fā)病率逐年增高[1]。最新數(shù)據(jù)顯示，我國的患病人數(shù)已達(dá)1.4億[2]，骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)病率不斷增高，嚴(yán)重危害老齡人口的生活質(zhì)量[3]。OP發(fā)病的根本原因在于骨吸收與骨形成的失衡，而目前防治多以抑制骨吸收的藥物為主，雖然抑制了骨改建過程，但難以恢復(fù)已丟失的骨量，且存在諸多不良反應(yīng)[4]。因此如何促進(jìn)骨形成是近年來研究的熱點(diǎn)[5]，同時探討其相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制，對預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松具有重大意義[6]。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)廣泛存在于多種組織和器官中，是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的多能干細(xì)胞。其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSC)研究最為廣泛深入，其分化去向在骨代謝中扮演了重要角色，外部因素及其信號處理過程如何調(diào)控其分化去向是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[7]。目前學(xué)者們已從胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、基因轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控開展了大量研究，但決定BMSC分化的關(guān)鍵步驟與因子仍屬深入探索的領(lǐng)域[8]。

外泌體(exosome)作為細(xì)胞間信號通訊的重要途徑，也是干細(xì)胞最重要的旁分泌形式[9]，在BMSC間的信號傳遞并影響其分化走向方面扮演十分重要的角色。近年來研究表明細(xì)胞間的交流會對骨形成產(chǎn)生很大的影響[10]，外泌體能通過信號蛋白、miRNA 等方式調(diào)控BMSC增殖和分化，也有研究發(fā)現(xiàn)BMSC來源的外泌體可以通過調(diào)控宿主BMSC的成骨分化功能改善骨質(zhì)疏松[11-12]，其在骨質(zhì)疏松的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。本文現(xiàn)就BMSC來源的外泌體在OP中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 外泌體的生物學(xué)特性

1.1 外泌體的概述

外泌體是由多種細(xì)胞分泌到胞外的納米級膜性泡，直徑約為30～100nm[13]，密度在1.13～1.21 g/mL，具有雙層脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)[14]，成杯型或球狀[15]，廣泛分布于血液、尿液、唾液、乳汁等多種體液中。含有蛋白質(zhì)、脂類、mRNA、miRNA、細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子受體等多種生物活性物質(zhì)[16]，能作為信號分子傳遞給靶細(xì)胞，從而介導(dǎo)細(xì)胞間的物質(zhì)傳遞與信息交流。

1.2 外泌體的形成

外泌體起源于胞內(nèi)體途徑[17]，其中最經(jīng)典的途徑是內(nèi)吞體運(yùn)輸分揀復(fù)合物(endosomal sorting complexs required for transport，ESCRT)。細(xì)胞膜表面的跨膜蛋白被吞噬形成初級核內(nèi)體，初級核內(nèi)體與細(xì)胞內(nèi)吞的囊泡融合，將囊泡中回收、退化或胞外分泌的部分吸收成為次級核內(nèi)體后，ESCRT-0 復(fù)合體會結(jié)合泛素化蛋白，形成的ESCRT-I和ESCRT-II會調(diào)節(jié)腔內(nèi)的小泡芽，形成的多泡體(multivesicular body，MVB)既可以被溶酶體降解，也可以通過胞吐作用將腔內(nèi)的小泡釋放到胞外空間形成外泌體。

1.3 外泌體的組成

外泌體含有豐富的蛋白質(zhì)，其中一類非特異性表達(dá)包括四分子交聯(lián)跨膜蛋白超家族(CD9、CD63、CD81、CD82)、 Alix、TSGl01和熱休克蛋白等，可作為識別外泌體的蛋白標(biāo)志物[18]。另一類是具有細(xì)胞源性的特異性蛋白質(zhì)，如T細(xì)胞來源的外泌體攜帶有CD3分子[19]，破骨細(xì)胞源性的外泌體內(nèi)含核因子-kb受體活化因子(RANK)[20]，這類蛋白質(zhì)可能與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能相關(guān)，在不同的生理病理?xiàng)l件下有表達(dá)的差異，具備生物學(xué)標(biāo)志物的潛力，對疾病的診斷有重要意義。

外泌體包含的另一大類重要物質(zhì)為核酸，包括DNA、mRNA、miRNA、lncRNA等，在細(xì)胞間的遺傳物質(zhì)信息傳遞過程中發(fā)揮重要作用，可調(diào)控生物信息，參與調(diào)節(jié)多種生理和病理過程[21]。在這些分子中，miRNA在基因表達(dá)方面的調(diào)控最受關(guān)注，其比例在外泌體中比母細(xì)胞更高[22]，且有研究表明，miRNA不是隨機(jī)整合進(jìn)入外泌體，而是母細(xì)胞具有的一種分類機(jī)制引導(dǎo)特定的細(xì)胞內(nèi)miRNA進(jìn)入外泌體[23]。

1.4 外泌體的生物學(xué)功能

外泌體的特異性功能與所含的蛋白質(zhì)、核酸及所處的微環(huán)境密切相關(guān)，其發(fā)揮作用是通過內(nèi)分泌或旁分泌的方式作用于靶細(xì)胞，與靶細(xì)胞膜融合或內(nèi)吞作用將信息傳遞給細(xì)胞進(jìn)而行使生物學(xué)功能[24]?，F(xiàn)階段認(rèn)為外泌體產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的方式主要有：一是外泌體表面的蛋白分子或脂質(zhì)配體直接激活靶細(xì)胞表面的受體，產(chǎn)生信號復(fù)合體并激活胞內(nèi)信號通路；二是外泌體可以與靶細(xì)胞的質(zhì)膜融合或內(nèi)吞直接進(jìn)入細(xì)胞，將自身攜帶的蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等活性分子帶到細(xì)胞內(nèi)，激活靶細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號通路，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的功能及生物學(xué)行為[25]。

2 BMSC外泌體在骨質(zhì)疏松中的作用

2.1 外泌體參與BMSC的骨向分化

近年研究發(fā)現(xiàn)，外泌體在細(xì)胞成骨分化中具有重要作用，BMSC來源的外泌體可以促進(jìn)成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)的增殖和分化，提示它在骨修復(fù)或骨組織再生中的潛能[26]。有研究表明，抑制細(xì)胞Rab27a(外泌體釋放啟動因子)表達(dá)后，明顯抑制了體外BMSC的成骨分化作用，而在培養(yǎng)體系中補(bǔ)充BMSC來源的外泌體則可以促進(jìn)細(xì)胞的成骨分化作用[27]。Narayanan等[28]在探討外泌體對成骨分化作用的研究中也發(fā)現(xiàn)相似的現(xiàn)象，同時發(fā)現(xiàn)從前成骨細(xì)胞MC3T3-E1中提取分離的外泌體可以促進(jìn)BMSCs分化成OB，對胞內(nèi)miRNAs的表達(dá)有顯著的影響，而這些變化是通過激活Wnt信號通路來促進(jìn)成骨分化。

目前也有研究顯示，除了BMSC來源的外泌體，其他一些特定細(xì)胞或組織來源的外泌體可促進(jìn)BMSC的成骨分化，但具體機(jī)制尚未闡明。Ekstrtom等[29]發(fā)現(xiàn)，人單核細(xì)胞分泌的外泌體對BMSC具有促成骨分化作用，該類外泌體與BMSC共培養(yǎng)后，其細(xì)胞表面的骨標(biāo)志基因Runx2、BMP-2的表達(dá)與對照培養(yǎng)基相比均顯著增加。人樹突細(xì)胞來源的外泌體同樣可以促進(jìn)人BMSC向OB分化[30]，經(jīng)作用后的BMSC堿性磷酸酶(ALP)的活性增高，Runx2表達(dá)升高，其促成骨分化作用可能與其內(nèi)含有大量與成骨分化相關(guān)的基因和蛋白有關(guān)。因此，外泌體促進(jìn)BMSC成骨分化的具體分子機(jī)制，仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

2.2 BMSC外泌體miRNA參與調(diào)控BMSC的骨向分化

BMSC分泌的外泌體中含有多種miRNA[31]，并參與調(diào)控BMSC的成骨分化功能。因其在基因表達(dá)調(diào)控中的關(guān)鍵作用，外泌體miRNA的功能已經(jīng)成為研究的焦點(diǎn)[32]。最近的研究揭示了許多參與骨骼重塑調(diào)控的骨源性外泌體miRNA，包括miR-30 d-5p、miR-133b-3p、miR-140-3p等43個miRNA在MC3T3-E1外泌體中高表達(dá)，這些miRNA可能參與到成骨細(xì)胞分化和功能的多種途徑中，如Wnt、TGF-β和鈣信號通路[33]。

人BMSC在成骨分化的不同階段中，其分泌的外泌體miRNA表達(dá)譜亦隨之改變，其中l(wèi)et-7a、miR-135b、miR-148a、miR-199b、miR-203、miR-218、miR-219、miR-299-5p、miR-302b在成骨分化過程中顯著上調(diào)，而miR-155、miR-181a、miR-221、miR-320c、miR-885-5p顯著下調(diào)，且Wnt通路信號分子的富集與成骨相關(guān)的外泌體miRNA差異化分布同步，這表明BMSC分泌的外泌體miRNA調(diào)控其成骨分化功能[34]。Qin等[35]的研究顯示，人BMSC來源的外泌體通過內(nèi)吞作用進(jìn)入成骨細(xì)胞內(nèi)并傳遞成骨相關(guān)的miRNA，其中miRNA-196a對調(diào)節(jié)成骨ALP、OCN、Runx2的表達(dá)及對成骨細(xì)胞的活性和分化具有正向調(diào)控作用，予以BMSC來源的外泌體對顱骨缺損大鼠進(jìn)行骨形成刺激，能促進(jìn)骨缺損處新骨再生和血管生成。BMSC來源的外泌體miRNA在骨代謝平衡起重要調(diào)節(jié)作用，未來仍需要進(jìn)一步探討多種miRNA對OP的影響，以通過調(diào)控外泌體中多種miRNA的表達(dá)提高治療OP的作用。

2.3 外泌體與成骨細(xì)胞

成骨細(xì)胞起源于BMSC，是骨形成的主要功能細(xì)胞，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化。Ge等[36-37]在研究成骨細(xì)胞外泌體并探索其潛在功能時，分離提取小鼠MC3T3外泌體并進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，確定了1 536種蛋白質(zhì)，其中172種蛋白質(zhì)與骨骼數(shù)據(jù)庫重疊，基因本體分析顯示外泌體主要參與蛋白質(zhì)的定位和胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)分析顯示與骨骼肌系統(tǒng)發(fā)育和功能、發(fā)育障礙、遺傳障礙和骨形成相關(guān)，其中EFNB1、轉(zhuǎn)化生長因子受體3、LRP6、骨形態(tài)蛋白受體1、SMURF1和真核起始因子2在成骨形成中起著重要的作用，這些外泌體來源的有價值的蛋白可能為骨質(zhì)疏松研究提供了新的前景。

也有研究發(fā)現(xiàn)，前成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞中提取分離的外泌體可以促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞(ST2)分化成成骨細(xì)胞，同時對胞內(nèi)miRNA的表達(dá)有顯著的影響，而這些變化是通過引起Axinl表達(dá)抑制及β-cateninn表達(dá)增強(qiáng)來激活Wnt信號通路來促進(jìn)成骨分化[38]。這些發(fā)現(xiàn)均提示了外泌體介導(dǎo)骨細(xì)胞微環(huán)境中細(xì)胞間的交流模式及骨重建機(jī)制。

2.4 BMSC外泌體與骨質(zhì)疏松

研究顯示，BMSC外泌體可有效改善骨質(zhì)疏松癥狀，促進(jìn)BMSC增殖、成骨分化及骨再生。 Furuta等[39]應(yīng)用CD9-/-小鼠建立骨折延遲愈合的動物模型，小鼠的骨愈合率明顯低于野生型小鼠，而注射BMSC來源的外泌體能夠促進(jìn)軟骨內(nèi)成骨，加速骨折愈合，注射缺乏外泌體的培養(yǎng)基則未出現(xiàn)這種情況。葉慶元等[40]注射小鼠來源的供體BMSC，能夠通過供體BMSC分泌外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)miR-26恢復(fù)雌激素缺乏骨質(zhì)疏松模型小鼠的BMSC功能并緩解骨質(zhì)疏松，為研究如何緩解與治療激素水平下調(diào)所造成的骨質(zhì)疏松提供有一定的參考價值。另有研究報道，miR-31水平在老年人和骨質(zhì)疏松癥患者的血漿中顯著升高，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，衰老內(nèi)皮細(xì)胞來源的外泌體分泌的miR-31被BMSC攝取，從而抑制間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，介導(dǎo)骨質(zhì)疏松的發(fā)展。血漿外泌體來源的miR-31在骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用，可能是一種有價值的骨質(zhì)疏松的生物標(biāo)志物，可作為骨質(zhì)疏松新的治療靶點(diǎn)[41]。

此外，Liu等[42]研究表明正常BMSC分泌的外泌體可調(diào)控系統(tǒng)紅斑狼瘡所致的骨質(zhì)疏松表型小鼠BMSC功能，增加小鼠的股骨密度，促進(jìn)骨再生，改善狼瘡所致骨質(zhì)疏松癥狀況，機(jī)制研究顯示由BMSC分泌的外泌體可將Fas蛋白轉(zhuǎn)移至模型小鼠BMSC內(nèi)，降低了細(xì)胞內(nèi)miR-29b的水平，導(dǎo)致Dnmt1介導(dǎo)的Notch1啟動子低甲基化的恢復(fù)。研究結(jié)果揭示了通過BMSC外泌體提供的Fas蛋白可調(diào)節(jié)miR-29b/Dnmt1/Notch表觀遺傳級聯(lián)來改善BMSC功能。Qi等[43]研究人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體(exosomes secreted by mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells, hiPSC-MSC-Exos) incorporateHiPSC-MSC-Exos)在體外對去卵巢大鼠來源的BMSC增值和分化的影響，hiPSC-MSC-Exos可增強(qiáng)BMSC的增殖和ALP的活性，上調(diào)成骨細(xì)胞相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平；進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)在骨質(zhì)疏松合并顱骨缺損大鼠模型中驗(yàn)證，其外泌體能顯著促進(jìn)骨缺損處新骨再生和血管生成，且hiPSC-MSC-Exos的效果隨著水平的增加而增加，這些作用的機(jī)制可能是通過外泌體內(nèi)所包含的功能性蛋白、脂質(zhì)、mRNA、miRNA釋放作用于目的細(xì)胞所介導(dǎo)的，為骨質(zhì)疏松的進(jìn)一步研究和臨床治療提供了新的思路和方法。

3 BMSC外泌體在骨質(zhì)疏松中的應(yīng)用前景和展望

MSC在生理或病理?xiàng)l件下產(chǎn)生的外泌體是細(xì)胞間通信的中心介質(zhì)，通過將蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA等傳遞給臨近或遠(yuǎn)處細(xì)胞，形成了一種全新的細(xì)胞間信息傳遞系統(tǒng)，影響細(xì)胞的生理狀態(tài)并與多種疾病的發(fā)生與進(jìn)程密切相關(guān)[20]。且在各種疾病模型中驗(yàn)證它們的功能與MSCs相似，在生物體內(nèi)如修復(fù)組織損傷、抑制炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等功能已得到證實(shí)[44]，且外泌體具有高穩(wěn)定性、易于儲存、無需增殖、便于定量使用等優(yōu)勢。

隨著生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了空前數(shù)量的治療疾病和延緩疾病進(jìn)程的潛在靶標(biāo)。然而很多靶標(biāo)因?yàn)樗幬镌诙喾N類型細(xì)胞的胞內(nèi)無法溶解或迅速被激活而不具有成藥性。而外泌體本身具有藥物載體的屬性可作為一種潛在的藥物載體備受關(guān)注，BMSC是目前被認(rèn)為產(chǎn)生外泌體能力最強(qiáng)的細(xì)胞，且適合大量的外泌體的生產(chǎn)，是理想的天然藥物傳輸載體[45]。同時BMSC分泌的外泌體的功能與其相似，但更具有保護(hù)和修復(fù)作用，又可減輕很多與BMSC移植有關(guān)的安全性問題，如組織骨化及鈣化的風(fēng)險，成瘤性的安全及免疫排斥問題。BMSC來源的外泌體參與BMSC間的信號傳遞并影響其分化走向，尋找外泌體中關(guān)鍵調(diào)控因素和藥物作用靶點(diǎn)，可成為治療骨質(zhì)疏松的一種具有良好前景的新型策略。

雖然BMSC來源的外泌體具有良好的應(yīng)用前景，但是目前應(yīng)用還處于初期研究階段。盡管在動物模型中已證實(shí)外泌體對促進(jìn)骨形成具有一定的效果，但將外泌體應(yīng)用于骨質(zhì)疏松的治療還面臨許多難題。例如如何高效地提取外泌體，保證復(fù)雜分類系統(tǒng)規(guī)范和生物活性，同時在動物實(shí)驗(yàn)注射BMSC外泌體的最佳濃度和時間均不明確，及存在如何使其準(zhǔn)確定位到靶組織和靶細(xì)胞等問題。隨著對外泌體研究的不斷深入，將更系統(tǒng)更準(zhǔn)確地了解其與靶細(xì)胞之間的信號機(jī)制，對疾病的診治和預(yù)防具有重要的意義，未來應(yīng)用前景廣闊。