動物配子體外發(fā)生技術的研究進展及其應用展望

宗 航， 田博文， 張 瑞， 賴振雨， 周子惠， 吳 菲， 雷初朝， 黨瑞華

(西北農林科技大學動物科技學院，陜西 楊凌 712100)

高等動物的配子體外發(fā)生技術的研究進程較為緩慢，主要有兩方面原因。首先，相對于各組織均可再生的后生動物門，哺乳動物及鳥類，尤其人類的再生受到嚴重限制甚至缺乏再生能力，不同組織器官的再生能力差異也十分顯著[1]。其次，配子發(fā)生過程經歷在多個不同的組織結構中，發(fā)育的時間亦有間隔性，且存在有絲分裂以及減數分裂的2個分裂過程，細胞內的表達調控通路多且復雜，參與調控的物質多，視黃酸(retinoid acid，RA)、孕酮、類無精癥缺失基因(deleted in azoospermia-like gene，Dazl)編碼的RNA結合蛋白等物質均參與了減數分裂的調控[2-7]。自Odor等[8]證明可以通過培養(yǎng)小塊卵巢在體外產生大量卵母細胞以來，近期該研究領域取得了重大進展。Hikabe等[9]通過加入卵巢細胞等的方法，在30 d內通過對成纖維細胞衍生的多潛能干細胞培養(yǎng)，產生了具有受精能力的小鼠卵母細胞。本文將論述近期配子體外發(fā)生技術的進展及其廣泛的應用前景。

1 配子體內發(fā)生過程

配子發(fā)生需要經過幾個嚴格的步驟，包括原始生殖細胞(primordial germ cells，PGCs)的形成、增殖，遷移到生殖嵴，分化成成熟的配子幾個過程[10]。

1.1 原始生殖細胞的形成、增殖與遷移

在胚外組織細胞分泌的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)胞外信號分子誘導下，原始生殖細胞首先在早期胚胎的上胚層中形成[11-12]，經有絲分裂后，數目增加并聚集于胚外中胚層和內胚層附近的原條中。在此期間BMP蛋白家族及無翼型小鼠乳腺腫瘤病毒整合位點蛋白家族(wingless-type mouse mammary tumor virus integration site family member，WNT)與PGCs表面受體結合，激活細胞內通路，維持PGCs的多能性[13-14]。小鼠PGCs的遷移起始于8日胎齡時，生殖嵴分泌干細胞衍生因子Ⅰ(stromal cell-derived factor1，SDF1)與PGCs細胞表面趨化因子受體Ⅳ(chemokine receptor type4，CXCR4)結合，后腸分泌干細胞生長因子(stem cell growth factor，SCF)與PGCs細胞表面干細胞生長因子受體(KIT receptor，c-kit)結合，共同趨化PGCs遷移至生殖嵴[15-17]。

1.2 配子細胞的分化與成熟

PGCs定植于性腺嵴后，經過一段時間快速的有絲分裂，使數目大量增加[18]，快速進入下一階段。與生殖嵴緊密相連的中腎細胞立即分泌RA。對于雄性個體，PGCs上調細胞色素P450家族成員26B1重組蛋白(cytochrome P450，family 26，member B1，CYP26B1)表達，抑制RA的積累[19]。進而抑制RA下游視黃酸誘導基因8(stimulated by retinoic acid gene，Stra8)表達，Stra8基因是減數分裂過程關鍵表達基因[20]，因而雄性生殖細胞分化停止。直至雄性個體性成熟后，生殖細胞合成視黃酸受體(retinoic acid receptor，RAR)，連續(xù)完成減數分裂全過程形成成熟精子。對于雌性個體，RA在細胞內的積累會激活Stra8基因，開始減數分裂，并停止于減數第1次分裂前期。性成熟后，雌性生殖細胞繼續(xù)減數分裂，并停止于減數第2次分裂中期，直到受精后完成分裂全過程[21]。

2 配子體外發(fā)生技術

配子體外發(fā)生過程可以分為3個部分：體外分化期、體外生長期、體外成熟期。體外分化即通過培養(yǎng)多潛能干細胞，誘導其在體外定向分化、形成初級卵母或精母細胞的過程。體外生長是配子在體外完成完整的減數分裂過程。體外成熟是指已受精的卵細胞在體外的早期培養(yǎng)并正常發(fā)生卵裂過程，以及完成減數分裂的精細胞體外變形成精子的過程。

2.1 配子的體外分化

初級卵母細胞或精母細胞可以分離胚胎期的干細胞經分化后產生，如胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESCs)、外胚層干細胞(epiblast stem cells，EpiSCs)、PGCs等，也可以通過成體干細胞(Adult Stem Cell，ASCs)的誘導分化產生。Hübner等[22]通過體外培養(yǎng)首次證明了ESCs體外具有形成卵母細胞的能力，并在培養(yǎng)基中形成了類似的卵泡結構，但具有很大的隨機性。Nayernia等[23]使用RA誘導，使成年小鼠骨髓干細胞成功分化精細胞，表明成體干細胞具有分化成生殖細胞的潛能，但試驗中仍存在部分細胞減數分裂停滯的現(xiàn)象。早期研究中的配子體外分化過程主要基于胚胎干細胞隨機分化后極少數的生殖相關干細胞的篩選，因而產生配子效率低，不易產生成活且健康的后代。

在之后的研究中，主要通過體外外胚層環(huán)境的構建、關鍵化學物質的誘導定向產生功能性的生殖相關干細胞。Nicholas等[24]在胚胎干細胞的培養(yǎng)基中加入RA、BMP4、SCF等物質成功誘導分化形成初級卵母細胞，并導入至小鼠卵巢中發(fā)育成熟。Hayashi等[25]從6.5日胎齡的小鼠胚胎外胚層中分離EpiSCs，使用BMP4誘導分化形成PGCs，并與12.5日胎齡胚胎提取的雌性性腺共同培養(yǎng)。雖然成功分化形成類似的卵母細胞，但效率較低，卵母細胞不易成活。Hayashi等[26]從3.5日胎齡的小鼠胚胎中提取胚胎干細胞，在培養(yǎng)基中加入MEK抑制劑(PD325901)、GSK3抑制劑(CT99021)及白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)誘導形成類似的外胚層干細胞，構建形成PGCs的外部環(huán)境，并在形成的第2天加入BMP4、SCF、LIF誘導分化形成PGCs[27]，導入缺乏內源性生殖細胞的小鼠曲細精管中，成功產生精子，受精后成功產下健康后代。

在最新的研究中，Hikabe等[9]利用小鼠皮膚細胞、尾細胞中含有的ASCs，誘導分化成ESCs，采用Hayashi等[27]的方法誘導形成初級卵母細胞，并與卵巢體細胞混合，重構為“卵巢”，并將重構的卵巢置于涂覆有膠原蛋白的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，產生了大量具有卵泡結構的卵母細胞。該步驟是本試驗中創(chuàng)新性一步，通過卵巢細胞混合培養(yǎng)，提供卵母細胞分化精細的外部環(huán)境，進而實現(xiàn)了從有絲分裂到減數分裂復雜分裂過程的跨越，最終實現(xiàn)了卵母細胞的體外成熟，體外完整的配子發(fā)育過程。早在先前的研究中，已經證明PGCs與卵巢體細胞的組合可以在功能上形成重建的性腺，進而形成初級卵母細胞。移植體內后，可完成配子發(fā)育的全過程[24,28-29]。Morohaku等[30]也通過卵巢細胞和卵母細胞的混合培養(yǎng)實現(xiàn)了卵母細胞的體外成熟。

2.2 配子的體外生長

大量的試驗證明，體外培養(yǎng)形成的初級卵母細胞跨越減數分裂過程是十分困難的[2,29,31]，而顆粒細胞的形成、卵泡的構建也被認為是卵母細胞形成的必要條件[3]。Eppig等[32]認為卵母細胞的成功構建關鍵在于維持顆粒細胞和卵母細胞間的信息交流，而顆粒細胞在調節(jié)卵母細胞發(fā)育中的作用取決于顆粒細胞的分化階段。因此，減數分裂及卵泡的成功構建是卵母細胞在體外生長中關鍵的兩步，其中雌激素等化學物質起關鍵性作用。Kezele等[33]認為雌激素在卵泡形成中存在抑制作用。Chen等[34]證明了雌激素通過細胞表面受體抑制卵母細胞囊腫的分解和卵泡的構建。Lees-Murdock等[4]發(fā)現(xiàn)SCF能夠促進卵泡的組裝，但不能使卵母細胞發(fā)育到次級卵母細胞。

Zhang等[7]通過將收集的小鼠PGCs細胞培養(yǎng)在前腔期顆粒細胞上，形成成熟的卵母細胞并受精，培養(yǎng)至桑葚胚階段。Zhang等[35]將新生小鼠睪丸細胞(初級精母細胞時期)注射于裸鼠背部，形成了睪丸組織及精子的發(fā)生，產生了可育后代。Hikabe等[9]將該技術改進，又在培養(yǎng)基中加入了聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)以及雌激素受體抑制劑(oestrogen inhibitor，ICI)。PVP是一類具有優(yōu)秀生理相容性和以及溶解性能的高分子化合物，可以在培養(yǎng)基中提供較大的膠體滲透壓[36-37]。Hikabe等[9]實驗表明PVP可以維持卵母細胞、顆粒細胞復合體的穩(wěn)定性，促進顆粒細胞的增殖。配子在體內生長發(fā)育過程中會受到激素的嚴密調控。同樣，在體外的條件下經激素的嚴格調控，配子才能實現(xiàn)完整的發(fā)育過程。在培養(yǎng)過程中加入雌激素抑制劑，降低培養(yǎng)基中由顆粒細胞產生的雌激素的濃度，才能使卵母細胞正常分裂且卵泡成功組裝[33-34]。

而對于精母細胞，由于其減數分裂是連續(xù)的進程，體外過程更為容易實現(xiàn)。Zhou等[38]將PGCs與新生小鼠睪丸細胞在RA、BMP蛋白家族存在的條件下共培養(yǎng)，在第6天添加卵泡雌激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)，在第14天便完成減數分裂產生精子細胞，將精子細胞注入減Ⅱ中期卵母細胞，成功受精并產下后代。

2.3 配子的體外成熟

哺乳動物卵母細胞的體外成熟過程，早在1959年已經實現(xiàn)[39]。而Steptoe等[40]最早應用于人類，“試管嬰兒”就是其較為成熟的應用。但這只是發(fā)育十分成熟的卵母細胞的體外培養(yǎng)，而對于較早階段的卵母細胞，雖已在很多哺乳動物中實現(xiàn)，但人類中還未成功受精并產下健康后代。造成這種情況的原因包括：人類卵子發(fā)生過程的持續(xù)時間長達數月，在延長期內維持人類卵母細胞的生存能力的困難， 以及可供研究的人類卵母細胞的稀缺性。而對于精子細胞體外成熟過程，未見有報道。

3 應用及展望

3.1 提高動物繁殖力，促進育種進程

配子體外發(fā)生技術的研究，不僅有助于了解卵子發(fā)生的調控機制，調控卵子發(fā)生，而且有助于提高哺乳動物以及其他動物的繁殖力[41]，大大提高動物生產效率。通過優(yōu)良畜禽體外的配子發(fā)生，可以產生大量的配子細胞，與體外受精，胚胎移植等技術相結合，快速產生大量優(yōu)良后代，加快育種進程。同時，該技術對野生動物的馴化具有重要意義。在自然界中有大量的物種可供人類使用，但經人類馴化成功并大量利用生產的只有幾種。很多物種在馴化的初期圈養(yǎng)過程中會出現(xiàn)生殖障礙的現(xiàn)象，從而使該物種難以馴化甚至不能馴化。利用此技術可以加快特種動物馴化馴養(yǎng)進程，人類可利用的種質資源將大大增加。

3.2 醫(yī)學上用于治療不孕不育

可以使用皮膚細胞誘導分化形成性母細胞，以代替自然狀態(tài)下卵巢或睪丸的功能產生配子。也可以將多功能胚胎干細胞導入到損傷、無法生成配子的睪丸或卵巢中，使之功能重現(xiàn)，從而實現(xiàn)不孕不育的治療[24,42]。如果該技術可以適應人類細胞的必要的安全性要求，它將繞過女性生育能力的主要限制因素，即卵母細胞的數量和質量[43]。作為一種治療不孕的方法，該方法可以幫助年輕婦女卵巢功能不全、接受體外受精的不孕婦女、因癌癥治療而導致生育能力受損的癌癥幸存者和絕經后婦女。這種治療策略已經應用于原發(fā)性的卵巢功能不全的患者，并且產生了健康的胎兒[44-45]。而對于睪丸功能受損的男性，也具有良好的治療效果，通過SCF、BMP4、LIF等多種物質的合理組合，高效地實現(xiàn)精原干細胞地誘導，成功治療不育小鼠并產下健康后代[46]。

3.3 與轉基因技術相結合

轉基因技術在很多動物中有所限制，例如禽類的轉基因，由于操作早期胚胎的困難，仍然非常低效。無論是逆轉錄病毒法，還是顯微注射法，甚至是早期胚胎細胞培養(yǎng)法轉基因的傳遞效率都非常低。調整技術次序，重構其配子發(fā)生可克服這種技術障礙[47]?？梢酝ㄟ^皮膚細胞等具有誘導多功能干細胞潛力的細胞體外培養(yǎng)，并通過逆轉錄病毒侵染轉基因。然后再誘導去分化、再分化生成PGCs，體外配子發(fā)生或將PGCs移植到睪丸或卵巢中完成了整個配子發(fā)生過程。

3.4 推動生殖生物學的發(fā)展

成功的體外配子發(fā)生為人類生殖細胞發(fā)育的各個方面提供非常有價值的信息，包括轉錄控制、表觀遺傳重編程、減數分裂和基因組穩(wěn)定性的機制[48]。這些知識反過來有助于辨別異常生殖細胞發(fā)育疾病，包括不孕不育，發(fā)育受損，生殖生理障礙，以及多種的遺傳或表觀遺傳的疾病[49]，促進早期疾病胚胎的篩選。