銅綠假單胞菌群體感應系統(tǒng)抗菌增效機制研究進展

饒 媚， 張素平， 史道華

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是引起醫(yī)院感染的主要病原菌之一，對多種抗感染藥物呈固有或獲得性多藥耐藥，常導致治療失敗，嚴重威脅人類健康。研發(fā)新型、安全、有效的抗菌藥物或引入能中和或阻斷細菌毒素產(chǎn)生、調(diào)控群體感應藥物，疫苗，聯(lián)用抗菌增效劑等非抗生素類藥物輔助抗感染，一直備受關注[1]。銅綠假單胞菌耐藥機制包括過表達外排泵、群體感應、產(chǎn)生修飾酶或滅活酶、外膜孔蛋白缺失、外膜低通透性等[2]。有研究認為群體感應系統(tǒng)（quorum sensing system，QSS）在銅綠假單胞菌耐藥中起著極其重要的作用[3]，本文就QSS抗菌增效機制的研究進展做一綜述，為靶向銅綠假單胞菌群體感應的治療及藥物研發(fā)提供新的思路。

1 QSS

QSS是細菌通過感應細胞外自身產(chǎn)生的分子進而對生物學功能進行調(diào)控的系統(tǒng)。研究表明QSS調(diào)控銅綠假單胞菌約4%～6%基因表達。銅綠假單胞菌的QSS包括以N-3-氧代十二烷酰-高絲氨酸內(nèi)酯（N-oxododecanoyl-homoserin，3-O-C12-HSL）為自誘導物的LasI/LasR信號系統(tǒng)、las基因編碼產(chǎn)生3-O-C12-HSL合成酶lasI，當細菌達到閾濃度時，結合到轉錄子lasR上，調(diào)控彈性蛋白酶、蛋白水解酶、外毒素等毒力因子表達；以N-丁?；?高絲氨酸內(nèi)酯（N-butanoyl-homoserine lactone，C4-HSL）為自誘導物的RhlR信號系統(tǒng)，rhl基因編碼產(chǎn)生C4-HSL合成酶RhlI，調(diào)控鼠李糖脂的表達，同時也影響LasI/LasR部分調(diào)節(jié)子的表達；以2-庚基-3-羥基-4-喹諾酮為自誘導物的喹諾酮信號分子（pseudomonas quinolone signal，PQS），當胞外PQS達閾濃度后，可啟動胞內(nèi)PQS與受體結合并調(diào)控綠膿菌素（pyocyanin，PCN）的產(chǎn)生。三個系統(tǒng)之間相互關聯(lián)與調(diào)控，其中LasI/LasR處于上游，激活其他兩個系統(tǒng)，RhI/RhlR對PQS負調(diào)控，PQS則起到連接LasI/LasR和RhI/RhlR兩個信號系統(tǒng)的作用[4-5]。

QSS與銅綠假單胞菌致病性和耐藥性密切相關，銅綠假單胞菌感染機體后，定植細胞通過直接擴散、受體識別等方式與3-O-C12-HSL等信號分子結合，誘導產(chǎn)生細胞因子，進而調(diào)節(jié)免疫應答，提高自身生存能力[6-7]。銅綠假單胞菌黏附于機體表面后通過分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白和脂質(zhì)蛋白形成致密生物膜（bio film），QSS調(diào)控生物膜黏附、群聚、形成等生物學行為從而顯著增加耐藥性[8-9]。此外，銅綠假單胞菌具有獨特外排泵，過表達主動外排系統(tǒng)是銅綠假單胞菌耐藥的主要機制之一。QSS與銅綠假單胞菌外排泵系統(tǒng)相關基因之間的相互調(diào)控同樣備受關注。

2 群體感應抑制劑（quorum sensing inhibitors，QSI）

與傳統(tǒng)抗菌藥物抗菌機制不同，QSI對細菌無選擇性壓力，較少發(fā)生耐藥，有望增強抗菌作用效果，緩解銅綠假單胞菌耐藥。呋喃酮是最早發(fā)現(xiàn)的具有QSI作用的天然化合物，其結構修飾產(chǎn)物C-30對銅綠假單胞菌的QSS具有顯著抑制作用，能協(xié)同抗菌藥物清除小鼠肺部感染[10]。目前發(fā)現(xiàn)的QSI種類越來越多，按其來源可分為植物來源、人工合成或提取以及臨床已用的藥物。

2.1 植物來源的QQSSII

香豆素是從植物中提取的酚類化合物，具有較強的抗感染和抗腫瘤活性，能抑制不同臨床分離銅綠假單胞菌菌株生物膜形成，調(diào)控QSS相關信號通路降低毒力因子表達，調(diào)控pqsABCDE和ambBCDE操縱子抑制QSS相關基因lasI、rhlI、rhlR的表達。環(huán)二鳥苷酸（C-di-GMP）是細菌第二信使分子，調(diào)節(jié)細菌細胞分化、生物膜形成、毒力因子產(chǎn)生等多種生物學行為，并受到二鳥苷酸環(huán)化酶（DGC）和磷酸二酯酶（PDE）調(diào)控，胞內(nèi)高濃度C-di-GMP可促進銅綠假單胞菌的生物膜形成，研究表明香豆素正向調(diào)節(jié)tpbA從而顯著降低C-di-GMP水平[8]。

迷迭香酸（rosmarinic acid）是從唇形科植物迷迭香中分離得到的水溶性天然酚酸類化合物，是一種天然抗氧化劑，具有較強的抗氧化能力和抗炎活性，同時還具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤活性。研究表明，迷迭香酸抑制128個基因的表達，包括多種毒力因子相關基因。迷迭香酸觸發(fā)QSS反應，參與調(diào)控銅綠假單胞菌的QSS信號系統(tǒng)。此外，迷迭香酸誘導的7個sRNA都編碼在接近QSS和 /或迷迭香酸誘導的基因區(qū)域[11]。

反式茴香油是八角油主要成分，采用QSI篩選法、lasB-gfp融合分析和毒力因子分析表明其具有QSI特性。反式茴香油在不抑制銅綠假單胞菌PAO1生長的情況下，可增加lasR的表達量、毒力因子產(chǎn)生量（彈性蛋白酶、蛋白水解酶、PCN）及降低群聚性分別為57%、59%、56%、95%及68%。分子對接和蛋白-配體相互作用研究表明，反式茴香油為3-O-C12-HSL類似物，可能與LasR蛋白結合而抑制銅綠假單胞菌的QSS、調(diào)控毒力因子的產(chǎn)生[12]。

黃芩苷為中藥提取的活性天然化合物，可抑制銅綠假單胞菌的生物膜形成，劑量依賴性增強多種抗菌藥物體外殺菌效果，抑制毒力因子表達。體內(nèi)研究表明，黃芩苷可提高小鼠清除銅綠假單胞菌的能力，聯(lián)用抗菌藥物顯著減少植入體中菌落的形成，明顯加強清除菌體能力。病理組織學顯示黃芩苷可減輕炎性反應，減少植入體周圍腹膜組織的細胞浸潤，提高腹腔感染小鼠的生存率[13]。

白千層屬揮發(fā)油及其主要成分4-萜二醇（TTO）具有潛在的QSI作用，100 μg/mL TTO能抑制PAO1的運動能力，同時能在極低濃度時抑制銅綠假單胞菌的QSS和生物膜形成[14]。白藜蘆醇可顯著增強氨基糖苷類抗生素（如妥布霉素、慶大霉素、阿米卡星、奈替米星）對銅綠假單胞菌的生物膜形成的抑制作用，增強該類抗菌藥物的療效[15]。大麥發(fā)芽時的產(chǎn)物荷丁堿對奈地米星具有協(xié)同抗生物膜形成作用[16]。此外，來源于中草藥具有QSI作用的還有肉桂酸、白頭翁、白芷、五味子、狗脊、白菊花、木犀草、馬鞭草等[17-19]。

2.2 菌類提取或人工合成的QQSSII

從人工合成的化合物中篩選具有潛在抗感染作用的化合物一直是抗菌藥物研究的領域和方向。Ravithej等[20]從50種化合物中計算機篩選潛在具有抗銅綠假單胞菌活性的化合物，發(fā)現(xiàn)3種化合物具有QSI活性，并能抑制相關毒力因子的表達。有學者從FDA批準的1 600種化合物中篩選靶向銅綠假單胞菌與喹諾酮信號分子結合的QSI，發(fā)現(xiàn)clofoctol活性最強，通過作用于喹諾酮信號分子結合蛋白PasR調(diào)控PCN等毒力因子表達，并降低銅綠假單胞菌的運動能力，抑制生物膜形成[21]。該藥對肺組織滲透性良好，被認為是潛在的治療肺部銅綠假單胞菌感染的活性藥物。

土曲霉中分離的terrein，能拮抗群體感應受體，減少毒力因子（彈性蛋白酶、PCN和鼠李糖脂）和生物膜形成，但不影響銅綠假單胞菌生長。此外， terrein對QSS信號分子產(chǎn)生及相關基因表達也有不同程度影響。terrein還可降低DGC的活性從而降低細胞內(nèi)C-di-GMP水平，這一作用可被外源性QSS配體逆轉[22]。黃曲霉提取物SSP13同樣具有下調(diào)細胞毒力因子和群體感應生物膜形成的活性[23]。

有研究利用銅綠假單胞菌的QSI-lasI生物傳感器，發(fā)現(xiàn)海洋鐮刀菌Z10的次生代謝產(chǎn)物具有QSS抑制活性。經(jīng)高效液相色譜法分離，獲得伊快霉素。伊快霉素亞抑菌濃度可抑制銅綠假單胞菌的生物膜形成、群聚運動和毒力因子產(chǎn)生。對大腸埃希菌pEAL08-2、pDSY的las、PQS和rhl系統(tǒng)也有抑制作用，還可下調(diào)QSS相關基因mRNA的表達。伊快霉素可作為抗銅綠假單胞菌的QSI，有望通過結構優(yōu)化設計開發(fā)新型抗感染藥物[24]。

海藻提取的一種低分子量海藻酸鹽低聚物（OligoG CF-5/20），已證實可降低銅綠假單胞菌的生物膜活性并破壞生物膜形成。生物傳感器檢測顯示OligoG CF-5/20顯著減少?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHL）分泌，C4-HSL和3-O-C12-HSL產(chǎn)量也顯著下降。此外，OligoG CF-5/20誘導24 h后，lasR和rhlR表達量明顯減少，生物膜生成量下降呈現(xiàn)劑量依賴性，與抑制DNA合成有顯著相關性，也與毒力因子PCN、鼠李糖脂、彈性蛋白酶和總蛋白酶的胞外產(chǎn)量相關[25]。

體外測試化合物的QSI活性既費時又費錢，且成功率低。計算機輔助設計與實驗室篩選相結合可提高發(fā)現(xiàn)新活性物質(zhì)的機遇。通過蛋白質(zhì)文庫，各種虛擬篩選法以及分子對接軟件可極大提高新藥的發(fā)現(xiàn)。FabI是烯酰還原酶催化的關鍵酶，在合成3-O-C12-HSL分子中起重要作用。近期有研究闡釋了銅綠假單胞菌內(nèi)FabI的晶體結構，在基于結構的虛擬篩選SB-VS方法中確定可能靶向烯基-?；d體蛋白還原酶，可能有助于設計7種QSS淬滅劑[26]。

2.3 已上市具有QSI作用的藥物

研究發(fā)現(xiàn)，已用于臨床的某些藥物具有潛在的QSI活性。早期研究顯示，低于MIC濃度的阿奇霉素可抑制銅綠假單胞菌的QSS，降低毒力因子表達[27]，進一步研究提示其可能的作用機制為阿奇霉素影響銅綠假單胞菌群體感應相關蛋白質(zhì)組學[28]。頭孢他啶是治療銅綠假單胞菌感染的第三代頭孢菌素，僅使用MIC濃度的1/4 即可通過調(diào)控QSS從而顯著抑制銅綠假單胞菌的生物膜形成[29]。長期、低劑量紅霉素治療非囊性纖維化支氣管擴張患者的銅綠假單胞菌感染，發(fā)現(xiàn)群體感應基因lasR明顯降低，但并沒有減少細菌數(shù)量，表明大環(huán)內(nèi)酯類抗生素還存在一種潛在的抑制群體感應作用的機制[30]。

HSL拮抗劑可阻斷細菌之間的通信和減少毒性，從而控制感染。在亞抑菌濃度下，倍他林和倍他林酸通過抑制細胞膜多糖代謝從而顯著抑制銅綠假單胞菌的生物膜和毒力因子產(chǎn)量。黏氯酸和黏硼酸作用于銅綠假單胞菌群體感應受體，使銅綠假單胞菌運動能力和生物膜形成下降[31]。有研究表明，乳酸對新生兒糞便中產(chǎn)酸乳球菌M7菌株的群體感應信號分子有影響，在一定濃度范圍內(nèi)，乳酸對銅綠假單胞菌短鏈HSL的產(chǎn)生和群游活性、彈性蛋白酶、蛋白水解酶、PCN以及生物被膜的產(chǎn)生均有抑制作用[32]。

有學者采用分子對接方法研究二甲雙胍與lasR和rhlR受體的可能結合，二甲雙胍能顯著降低紫堇色素的生成，對PCN、溶血素、蛋白水解酶、彈性蛋白酶均有明顯抑制作用，能顯著降低銅綠假單胞菌的生物膜形成、浮游活性，增加對氧化應激的敏感性。研究表明二甲雙胍通過氫鍵和靜電相互作用與lasR結合，但僅通過氫鍵與rhlR結合 [33]。

阿司匹林是傳統(tǒng)的解熱鎮(zhèn)痛藥，具有消炎、抗風濕、抑制血小板聚集的作用。近來研究顯示，阿司匹林具有抗菌增效作用，6 mg/mL可在不影響銅綠假單胞菌生長情況下顯著降低群體感應信號以及彈性蛋白酶、總蛋白酶和PCN的表達。阿司匹林還可顯著降低菌體活動力和生物膜生成，降低lasI、lasR、rhlI、rhlR、pqsA和pqsR基因的表達。此外，還減少假單胞菌毒素exoS和exoY的表達。阿司匹林通過交互發(fā)生的芳基、lasR受體、Tyr-88通過強π-π堆積相互作用，與阿司匹林受體復雜的構象變化有關。阿司匹林僅對銅綠假單胞菌具有抑制其毒力因子表達的作用，對大腸埃希菌無此作用[34]。

3 外排泵系統(tǒng)及其與QSS相互關聯(lián)

過表達主動外排系統(tǒng)是銅綠假單胞菌耐藥的主要機制之一，如MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM、MexJK-OprM、MexGHI-OpmD和MexVW-OprM，這些外排系統(tǒng)均屬于耐藥/結節(jié)化/細胞分化家族（resistance/nodulation/cell division family，RND）。研究表明，RND外排泵能對特定的群體感應信號分子進行外排，胞外的信號分子達到閾值后，與對應的群體感應相關蛋白形成復合物，提高RND外排泵基因的表達，RND外排泵基因的過量表達進一步促進QSS的調(diào)控作用[35]。RND外排泵家族與QSS之間存在緊密的相互作用，QSS參與RND外排泵基因表達的調(diào)控，RND外排泵將部分群體感應信號分子作為底物進行選擇性外排，兩者相互影響相互依賴[36]。

RND外排泵的特殊轉運機制使其能轉運不同類型化合物并以此方式參與QSS的調(diào)控，群體感應信號分子也成為RND外排泵的底物，通過QSS影響細菌的生物學特性[37]。銅綠假單胞菌的LasI/LasR、RhlR和PQS 3個QSS信號系統(tǒng)存在高度相關性，以C4-HSL和3-O-C12-HSL為信號分子的rhl和las，在很大程度上QSS調(diào)控銅綠假單胞菌的生物學功能。Alcalde-Rico等[38]研究發(fā)現(xiàn)，過表達MexCD-OprJ的nfxB突變株，胞內(nèi)外3-O-C12-HSL含量均高于野生PAO1菌株；處于對數(shù)生長晚期的nfxB突變株，胞外C4-HSL含量明顯低于野生株，而達平臺生長早期時其含量與野生株接近，可能原因為該物質(zhì)可在細胞膜內(nèi)外自由彌散。過表達MexCD-OprJ同時使QSS相關毒力因子表達量減少，QSS調(diào)控相關基因表達量降低。由此可見，干擾外排泵相關信號通路能影響QSS信號傳遞，是一種潛在的治療策略。

多項研究顯示，外排泵抑制劑（EPI）能同時抑制QSS調(diào)控的銅綠假單胞菌的生物膜形成，含銅的EPI如納米銅在抑制MexAM-OprM表達的同時減少生物膜形成[39]。傳統(tǒng)EPI如Phe-Arg-?naphthylamide（PA ? N）可改變銅綠假單胞菌野生株PAO1和臨床分離株的QSS信號分子表達和QSS調(diào)控的毒力因子表達。EPI可通過QSS降低細菌的生物膜形成能力，同時恢復傳統(tǒng)抗生素的抗菌活性 [40]。

銅綠假單胞菌突變株群體感應受到鄰近非突變株的信號調(diào)控。mexT是編碼外排泵MexEF-OprN的激活因子，mexT突變株可介導MexEF-OprN活性從而調(diào)控群體感應lasR和rhlR蛋白活性。MexEFOprN介導耐藥菌株抗生素MIC增加，mexT不僅能增強菌群間協(xié)作，同時在銅綠假單胞菌選擇性耐藥中也起協(xié)同作用[41]。RND外排泵主要依賴ATP提供動力完成膜內(nèi)外藥物的轉運，QSS參與菌體內(nèi)碳代謝的調(diào)控，負調(diào)控葡萄糖攝取、糖酵解途徑、戊糖磷酸途徑、能量代謝途徑和核苷酸代謝途徑；正調(diào)控三羧酸循環(huán)、乙醛酸循環(huán)和草酸循環(huán) [42]。

銅綠假單胞菌耐藥趨勢日漸嚴重，極大地挑戰(zhàn)著現(xiàn)有抗菌藥物的療效，新型抗銅綠假單胞菌藥物的研發(fā)迫在眉睫。QSI不僅可以提高病原菌的藥物敏感性，還能延緩細菌耐藥，是抗感染治療研究的新領域，但其潛在的毒性、安全性、特異性、作用機制等尚不明確，限制其臨床應用。針對銅綠假單胞菌耐藥靶標，尋找新的具有應用前景的抗菌增效藥物，對銅綠假單胞菌感染的治療有著深遠的意義。