杜氏肌營養(yǎng)不良癥治療研究進展

楊一嫻 李昌盛 王蓓蕾 黨素英

1.上海交通大學醫(yī)學院，上海 200025；2.上海交通大學醫(yī)學院生物化學與分子細胞生物學系，上海 200025

杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）是一種全身肌肉呈漸進性損傷和運動功能減退的致死性X 連鎖隱性遺傳病?；純憾嘤?～4歲出現(xiàn)步態(tài)異常，10～12歲逐漸喪失行走能力，最終在20～30歲死于心肺功能衰竭。男嬰發(fā)病率為1/3500，我國每年有400～500例DMD 男嬰出生，累計患者7萬～8萬人，是世界上該病患者人數(shù)最多的國家之一。該病發(fā)病原因是位于Xp21.2-p21.1的編碼抗肌萎縮蛋白（Dystrophin）的DMD 基因突變，導致Dystrophin 蛋白在肌細胞膜上缺失，患者肌細胞變性、壞死繼而脂肪結締組織增生。DMD 基因突變類型有多種，大片段缺失占60%～65%，大片段重復占5%～10%，點突變、小片段缺失和重復占25%～30%。雖然目前尚無非常有效的治療方法，但隨著對DMD 的發(fā)病機制和病理變化過程愈漸深入的認識，對其治療的研究與相關臨床試驗有了很多新的突破。本文對DMD 近年來相關研究進展綜述如下：

1 治療方法

1.1 對癥治療藥物

Dystrophin 蛋白缺失會導致一系列病理變化，包括肌肉萎縮、炎癥、鈣過載、氧化壓力、組織缺血等。針對這些病理變化過程的相關藥物治療可以使所有患者獲益。

1.1.1 激素 激素是目前認為能夠減慢DMD 患者肌力和運動功能衰退的唯一藥物，長期每日服用糖皮質激素能明顯延緩患者病情進展。它的作用機制主要是通過抑制NF-κB 通路抑制炎癥，激活鈣調磷酸酶NFAT通路抑制肌壞死。目前強的松和強的松龍是最常用的激素治療藥物，美國FDA 批準的地夫可特也可以用于DMD，且副作用更小[1]。近年來正在研發(fā)溫和激素Vamorolone（VBP15），相對于傳統(tǒng)激素，能以更小的副作用獲得同等療效[2]。

1.1.2 其他針對NF-κB 的藥物 脂聯(lián)素和NEMO 結合結構域（NBD）的小分子模擬物可以降低NF-κB 的活性（已在DMD 疾病小鼠mdx 小鼠和肌營養(yǎng)不良癥金毛獵犬中表現(xiàn)出更好的治療效果），減少炎癥，促進肌肉再生，有望成為治療DMD 新的方法[3]。Edasalonexent（CAT-1004）也是NF-κB 核因子抑制劑，二期臨床實驗結果顯示，服用該藥物的DMD 患者運動功能得到一定改善，且未發(fā)現(xiàn)安全問題[4]。目前該藥物正在進行三期臨床實驗。

1.1.3 調節(jié)肌肉細胞中鈣水平的藥物 DMD 的病理特征之一是鈣調節(jié)異常而造成肌肉損害，因此調節(jié)肌肉細胞中鈣含量能夠減緩DMD 疾病的發(fā)展。Poloxamer188 NF 能封閉肌肉纖維損害后留下的微孔，阻止鈣滲透，有效改善橫膈膜的功能，改善呼吸功能[5]，該藥物目前正在進行二期臨床實驗。Omega3能夠顯著降低心臟和肌肉中總鈣水平，對DMD 疾病晚期患者有一定的緩解作用[6]。另外，AT-300通過阻斷鈣通道[7]，BGP-15促進肌質網(wǎng)膜鈣ATP 酶（SERCA）功能都能調節(jié)細胞中鈣含量[8]，減緩DMD 疾病的進展。

1.1.4 促進肌肉生長 Myostain 蛋白能夠限制人體肌肉過度生長，因此抑制這種蛋白表達可以增加肌肉生長，起到治療作用。BMS-986089、Domagrozumab 都是正在開展相關臨床實驗的Myostain 蛋白抑制劑，到目前為止，患者耐受性較好[9]。組蛋白脫乙酰酶能通過改變細胞內DNA 的三維折疊影響基因的表達活性，影響肌肉細胞再生能力和收縮功能，也會促發(fā)炎癥。DMD 患者中該酶水平高于正常人，因此抑制該酶的藥物Givinostat 可以促進患者肌肉生長，目前該藥物已進入三期臨床實驗[10]。utrophin 蛋白的結構和功能與抗肌萎縮蛋白相類似，出生后會被抗肌萎縮蛋白代替，只保留在神經肌肉接頭處。Ezutromid 能夠增加utrophin蛋白的表達，彌補患者肌肉中抗肌萎縮蛋白的不足，達到治療目的。二期臨床實驗結果已顯示該治療方法的價值[11]。

1.1.5 抗纖維化 DMD 患者體內轉化生長因子（TGF）-β通常過表達，且TGF-β 水平與患者的肌肉組織纖維化程度相關，因此抑制TGF-β 可以減少肌肉纖維化，減輕DMD 癥狀。常山酮是TGF-β 信號通路下游Smad3磷酸化的抑制劑，能增強肌肉中衛(wèi)星細胞的活性及肌細胞的存活，減輕患者肌肉組織的纖維化和炎癥，目前HT-100（緩釋常山酮）正在進行臨床試驗[12]。小分子酪氨酸激酶抑制劑Nintedanib 能降低成纖維細胞增殖和轉移能力，減少纖維化基因如COL1A1、COL3A1、FN1、TGFB1和PDGFA 的表達。研究中Nintedanib 減弱了mdx 小鼠骨骼肌的纖維化并誘導功能性肌肉改善，顯示出其成為DMD 藥物的潛能[13]。

1.1.6 針對無義突變的通讀療法 約15%的DMD 患者是由于點突變導致了終止密碼提前出現(xiàn)使mRNA翻譯提前終止，不能產生完整的蛋白。PTC 制藥公司研發(fā)生產的Ataluren（Translarna）可以與核糖體結合，使其翻譯含提前終止密碼子mRNA，從而能表達完整蛋白質。該藥已在2014年獲得歐洲醫(yī)藥管理局條件性批準用于5歲以上有行走能力的無義突變DMD 患兒，近年來進一步被批準用于2～5歲無義突變DMD患兒[14]。關于其使用范圍的臨床研究正在進行。

1.2 物理治療

適量的運動訓練以及應用矯形支具可以刺激DMD 患者肌肉蛋白質的合成，延緩呼吸衰竭，防止關節(jié)攣縮。近年來有研發(fā)虛擬現(xiàn)實（VR）游戲訓練方案以增加訓練的趣味性，也有研發(fā)供DMD 患者使用的機器人上肢外骨骼，是使DMD 患者能夠繼續(xù)使用手臂功能的可移動設備。

1.3 基因治療

1.3.1 基因替代療法 基因替代療法是指在DMD 患者基因組中插入外源的DMD 基因，表達出有功能的Dystrophin 蛋白，以緩解患者癥狀的方法。由于DMD基因大，受腺相關病毒（常用的基因載體）裝載容量的限制，一般采用截短的微型DMD 基因microdystrophin。研究者對DMD 實驗狗進行microdystrophin 基因治療后，實驗狗肌肉退化速度降低，且沒有發(fā)現(xiàn)嚴重的副作用[15]。美國現(xiàn)已開展微型DMD 基因治療的一期和二期a 的臨床實驗。因microdystrophin 不能發(fā)揮全長Dystrophin 的功能，研究者也在研究如何擴大基因載體的容量。雙腺相關病毒基因載體技術[16]和慢病毒載體可能用來裝載全長的DMD 基因[17]。

1.3.2 外顯子跳躍法 針對移碼突變導致的DMD 疾病，利用反義核苷酸與pre-RNA 雜交，誘導切除特定的外顯子，能使移碼突變的mRNA 閱讀框恢復，可編碼產生截短的Dystrophin 蛋白，恢復其部分功能。FDA在2016年批準的eteplirsen 是一種能夠跳躍51號外顯子的反義核苷酸，適用于大約13%的DMD 患者治療。使用etepliesen 長期治療能促進有功能的Dystrophin 蛋白表達[18]，延緩患者呼吸功能的下降[19]，但eteplirsen 療效需進一步確認和改善。目前已開發(fā)出新一代跳躍51號外顯子治療藥物，新加入的細胞滲透肽能夠提高藥物滲透入細胞的能力，從而提高治療效果[20]，另一新開發(fā)出的51號外顯子跳躍藥物WVE-210201早期研究數(shù)據(jù)顯示效果強于eteplirsen[21]，兩者都處于一期臨床實驗階段。53號和45號外顯子跳躍藥物golodirsen 和casimersen 也在進行臨床實驗。實驗發(fā)現(xiàn)治療后患者抗肌萎縮蛋白有明顯增加[22]。

1.3.3 基因編輯 CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的基因編輯既可通過引入小的插入或缺失使移碼突變的DMD 基因恢復編碼框（reframing），又能誘導外顯子跳躍，還能通過基因重組糾正無義突變等。利用基因編輯的方法，去除mdx 實驗鼠突變的21～23外顯子，恢復DMD基因編碼框，實驗鼠Dystrophin 蛋白的表達增加，心肌的功能有所恢復[23-24]。對缺失DMD 基因50外顯子的實驗鼠進行基因編輯實現(xiàn)reframing 或跳躍51號外顯子，同樣顯示了良好的治療效果[25]。目前遞送基因編輯組件一般采用病毒載體，存在有效率低及安全性差等問題。研究者設計了一種新的遞送方法CRISPR-Gold，用金納米粒子裝載基因編輯組件進入細胞。實驗中對mdx 小鼠肌肉細胞注射，與對照組相比抗肌萎縮蛋白修復增多，肌肉力量增強[26]。

1.4 干細胞療法

干細胞是一種具有自我復制能力并且可以分化成多種功能細胞的多潛能細胞。干細胞療法是將自體或同種異體干細胞移植到DMD 患者體內，使其分化成肌細胞并表達肌萎縮蛋白，從而治療患者。

心肌損害是患者死亡的其中一個非常重要的原因，因此正在研究一種心肌干細胞療法CAP-1002，獲取健康供體的心臟組織進行培養(yǎng)后注入患者的冠狀動脈至心臟，目前正在進行的一期、二期臨床實驗顯示了該方法的安全性，并且患者的心臟和手臂功能得到明顯改善[27]。除此之外，誘導多能干細胞（iPS）、骨髓基質干細胞（MSCs）、肌源性干細胞（MDSCs）都有其對DMD 進行干細胞移植治療的潛力。但多數(shù)干細胞移植還存在同種異體免疫反應、低存活率、移植量限制及形成腫瘤的潛在風險等問題。研究者開發(fā)了嵌合細胞療法，將正常供體的細胞和患者細胞融合后制備嵌合細胞，再移植進mdx 小鼠中，結果顯示小鼠肌肉力量和功能顯著改善，且因為帶有自體細胞，相對副作用少[28]。

干細胞療法還可以與基因治療相結合，對來自DMD 患者的干細胞進行基因修復，基因修復后的干細胞在實驗室中培養(yǎng)分化為肌肉細胞，再將這些肌肉細胞注射進mdx 小鼠體內，結果小鼠產生了健康的肌肉纖維和肌肉衛(wèi)星細胞，肌肉功能也有明顯的改善。使用改造后的干細胞治療mdx 小鼠，小鼠更短時間內就生長出健康的肌肉纖維[29]。

2 展望

針對DMD，有很多治療方法目前正在研究中。其中基因治療DMD 的研究在近年來取得了較大進展，包括治療手段的多樣化及遞送載體的不斷改進，但基因治療中很多潛在隱患也需要進一步解決。隨著基因編輯技術的發(fā)展，干細胞和基因治療相結合的療法展現(xiàn)出了良好的前景。對癥治療的方法，由于其不像基因治療對患者突變類型有要求，可造福所有患者，容易快速地進入臨床實驗，也是不可忽視的研究方向。物理治療方法相對來說只能延緩患者病情，但其能夠延長患者壽命，提高患者生存質量，值得推廣和發(fā)展。目前，眾多的治療方法對動物模型包括mdx 小鼠及GRMD 金毛狗都已經展現(xiàn)出較好的治療效果，但是在人類身上還需要進一步臨床實驗驗證，以確保藥物的有效性和安全性，避免出現(xiàn)嚴重的副作用。相信目前仍無藥可治的DMD 在不久的將來會在研究者們共同的努力下最終被攻破。