病毒樣顆粒作為口蹄疫病毒抗原表位載體的研究進展

李 茜，代軍飛，王 俊，丁耀忠，馬 炳，劉永生，張永光，張 杰

(中國農(nóng)業(yè)科學院 蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室/國家口蹄疫參考實驗室,甘肅 蘭州 730046)

1 病毒樣顆粒簡介

病毒樣顆粒(virus-like particles,VLPs)是由一種或多種病毒蛋白組裝形成的無病毒核酸的空心顆粒。VLPs具有與病毒粒子相似的外部結(jié)構(gòu)和抗原性，能攜帶外源蛋白，是構(gòu)建多價疫苗的理想載體[1]。1978年，Brady和Consigli發(fā)現(xiàn)多瘤病毒的主要衣殼蛋白能自我組裝成VLPs[2]。1984年，《Nature》雜志刊登了乙型肝炎病毒表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBsAg)VLPs疫苗的試驗結(jié)果，當接種人血清源的同源或異源亞型adr和ayw病毒時，疫苗接種的黑猩猩完全受到保護[3]。1986年，HBs Ag-VLP疫苗被批準用于預防人HBV感染[4]。GSK公司生產(chǎn)的Engerix和Merck公司生產(chǎn)的Recombivax HB成為了世界上第一批VLPs疫苗[5]。隨著研究的深入，研究者們發(fā)現(xiàn)了多種病毒的衣殼蛋白都能夠自我組裝成VLPs[6]。

VLPs是制備病毒疫苗較為理想的重組蛋白抗原，它具備以下優(yōu)點:(1)不含病毒核酸；(2)與病毒顆粒相近的免疫原性；(3)可經(jīng)MHC Ⅰ類和Ⅱ類分子提呈，激動CD4+輔助T細胞和CD8+細胞毒性T淋巴細胞；(4)能激活B細胞產(chǎn)生高滴度的抗體；(5)本身具有佐劑功能；(6)具有良好的生物相容性，可以作為載體呈現(xiàn)其他抗原[6]。

2 口蹄疫病毒的概述

口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)，可引起豬、牛、羊及其他偶蹄類動物的急性、熱性、高度接觸傳染性和可快速遠距離傳播的自然疫源性疾病口蹄疫(Foot and Mouth Disease,FMD)[7]?？谔阋呖梢栽斐删薮蟮纳鐣绊懞徒?jīng)濟損失[8]，是世界動物衛(wèi)生組織(World Organisation for Animal Health,OIE)法定向其報告的動物傳染病之一。

FMDV有7個血清型，每個血清型都易發(fā)生抗原變異，不能形成交叉免疫保護[9]。FMDV核酸為單股正鏈RNA[10]，其基因總長為8300個核苷酸，僅編碼一條多肽鏈，其在蛋白酶的作用下裂解產(chǎn)生4種不同的結(jié)構(gòu)蛋白(VP4、VP3、VP2和VP1)和一些非結(jié)構(gòu)蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)[11]。其中，結(jié)構(gòu)蛋白VP1的G-H環(huán)(G-H loop)含有口蹄疫病毒最重要的抗原位點和識別整合素受體的RGD基序，其周圍是高度可變區(qū)，可以作為外源抗原表位的插入或者替換位點。目前，防治口蹄疫主要是預防接種疫苗，但是傳統(tǒng)的滅活苗或弱毒苗有散毒和突變的危險，疫苗的免疫效果還與運輸、保存條件等相關(guān)。所以研制安全、低成本、易保存的新型FMD疫苗迫在眉睫。

3 FMDV抗原表位的預測

反向遺傳學的興起為研制新型FMDV疫苗提供了理論支持，它利用現(xiàn)代生物技術(shù)和分子病原學，通過分析病毒的基因組序列來預測其所有抗原信息，篩選出合適的抗原用于制備疫苗。這種方法與傳統(tǒng)制備疫苗的方法完全不同，將其稱為反向疫苗學[12]。

云濤等[12]利用計算機技術(shù)和分子生物學軟件對口蹄疫病毒OLZ02株采用Garnier-Robson法[13]、Chou-Fasman法[14]預測其結(jié)構(gòu)蛋白α螺旋、β折疊、轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲；用Karplus-Schulz法[15]預測了結(jié)構(gòu)蛋白的柔軟區(qū)域；用Kyte-Doolittle法[16]分析了其各結(jié)構(gòu)蛋白的親水性；用Emini法[17]預測了各結(jié)構(gòu)蛋白的表面可能性；用Jameson-Wolf法[18]預測了各蛋白的抗原指數(shù)。眾所周知，α螺旋、β折疊用于維持蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，不適合作為抗原表位。柔軟區(qū)域、轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲比較疏松，容易與抗體結(jié)合。因此，綜合評價FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的抗原表位，表明VP1蛋白含有的B細胞優(yōu)勢抗原表位最多，是研制口蹄疫新型疫苗的首選免疫原。

4 FMDV衣殼蛋白的體外組裝

雖然FMDV衣殼蛋白組裝的具體過程目前仍不清楚，但體外組裝試驗證實被感染的細胞中形成了幾種不同的中間體[7]。首先，VP0、VP1和VP3形成5 S原粒，5個原粒隨后組成12 S五聚體，12個五聚體構(gòu)成70 S的病毒衣殼，在RNA包入衣殼的過程中，VP0裂解成VP4和VP2。

Abrams等將P1-2A-3C基因序列置于噬菌體的T7啟動子后構(gòu)建重組體，在牛痘病毒表達系統(tǒng)中表達FMDV衣殼蛋白后，感染BSC 40細胞[19]。蔗糖密度梯度離心結(jié)果表明：樣品的沉淀物中有70 S VLPs，電鏡下觀察到直徑為30 nm的VLPs。使用單克隆抗體檢測特定抗原表位表明形成的VLPs具有天然病毒粒子的活性。Mohana等構(gòu)建了含有O型FMDVP1-2A-3C基因的重組桿狀病毒，結(jié)構(gòu)蛋白P1-2A和蛋白酶3C在昆蟲細胞sf9中得到共表達，成功組裝成VLPs[20]。Bhat等將O型FMDV的P1-2A基因和突變的3C基因嵌入到載體構(gòu)建重組表達載體，經(jīng)藍白斑篩選后得到的重組桿粒轉(zhuǎn)染sf9細胞，細胞毒傳代后經(jīng)SDS-PAGE檢測到VP0、VP1和VP3蛋白，雙抗夾心ELISA驗證表達的抗原具有很好的抗原性，表達的蛋白并最終組裝成直徑約25 nm的VLPs[21]。Veerapen等構(gòu)建重組體使FMDVP1-2A基因在本塞姆氏煙草中短暫表達，并沒有3C蛋白酶，P1-2A多蛋白被有效地加工成其組分結(jié)構(gòu)蛋白，隨后組裝成VLPs，每克鮮葉材料的VLPs產(chǎn)量為0.030 μg；使用部分純化的VLPs在小鼠中測試免疫原性，結(jié)果顯示有FMDV特異性抗體產(chǎn)生[22]。Michael等利用FMDV 3C(L127P)突變體，可顯著增加重組FMDV衣殼蛋白的產(chǎn)量，并在哺乳動物細胞中產(chǎn)生了FMDV VLPs，用單劑量該VLPs作為疫苗可以保護實驗動物牛在同源FMDV的攻擊下免于感染[23]。Guo等利用SUMO表達系統(tǒng)將Asia I型FMDV的VP1、VP3和VP0與SUMO融合后在大腸桿菌中表達，切除SUMO基團后，3個結(jié)構(gòu)蛋白組裝成VLPs。使用此VLPs免疫豚鼠、豬和牛，能刺激動物機體產(chǎn)生特異性免疫應答，并檢測到T細胞的增殖和細胞因子IFN-γ的分泌。另外，用同源FMDV攻擊該VLPs免疫的動物，牛的50%保護劑量(PD50)高達6.34[24]。Xiao等在大腸桿菌中開發(fā)了一種共表達系統(tǒng)，通過單個質(zhì)粒串聯(lián)驅(qū)動FMDV衣殼蛋白(VP0、VP1和VP3)的表達，共表達的FMDV衣殼蛋白(VP0、VP1和VP3)通過10 L規(guī)模的發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)，并且色譜純化的衣殼蛋白在體外自動組裝為VLP。用該VLPs接種的牛顯示出高保護效力，PD50達到每劑11.75[25]。

5 嵌合FMDV抗原表位的VLPs研究進展

5.1 FMDV-VLPs作為FMDV抗原表位的載體

Dong等將FLAG標簽插入FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1的GH-Loop可變區(qū)不影響VLPs的形成，說明外源肽段的插入不影響FMDV衣殼蛋白的空間結(jié)構(gòu)，但插入肽段的大小會影響VLPs的組裝效率[26]。將亞洲Ⅰ型口蹄疫病毒抗原表位插入O型口蹄疫病毒可變區(qū)，結(jié)果外源表位的插入沒有影響型O型口蹄疫VLPs的空間結(jié)構(gòu)，同時發(fā)現(xiàn)制備的嵌合VLPs能夠被O型口蹄疫和亞洲Ⅰ型特定表位的抗體識別，說明可變區(qū)抗原表位的插入沒有破壞型口蹄疫病毒可變區(qū)的免疫表位，還將亞洲I型口蹄疫病毒特定免疫表位呈遞到病毒衣殼表面[24]。Liu等使用O型FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1和A型FMDV的VP2、VP3、VP4構(gòu)建嵌合型VLPs。用該嵌合型VLPs接種的5只豚鼠中的4只完全免受FMDV毒株O/MAY98攻擊[27]。Dong等將FMDV 3D基因的反義RNA包裝入VLPs，ELISA和Western blot檢測結(jié)果表明該表位RNA VLPs可以產(chǎn)生免疫反應。在小鼠和豚鼠中測試疫苗的效力，表明該表位RNA VLPs疫苗保護了40%的乳鼠和85%(17/20)的豚鼠。實驗數(shù)據(jù)說明表位RNA VLPs疫苗將來在探索和開發(fā)針對FMDV的疫苗中具有一定的價值[28]?？谔阋卟《?FMDV)的7種血清型中，O型占優(yōu)勢，但其病毒衣殼比其他血清型更敏感，使得在低pH值昆蟲細胞中產(chǎn)生O型VLP更加困難。Li等開發(fā)了一種用于O型FMDV的新型基于VLPs的候選疫苗。該嵌合VLPs由來自血清O型的VP1和來自血清Asia I型的病毒衣殼蛋白的片段組成，它以類似于滅活疫苗的功效保護豚鼠免受FMDV攻擊。這些結(jié)果均表明FMDV結(jié)構(gòu)蛋白能形成VLPs，并具有產(chǎn)生針對相應血清型FMDV特異性反應的潛力[29]。

5.2 HBc-VLPs作為FMDV抗原表位的載體

乙型肝炎病毒核心蛋白(hepatitis B virus core protein,HBc)是HBV的核衣殼蛋白，HBc經(jīng)大腸桿菌重組表達后可在體外自主包裝成VLPs，并具有強烈的免疫原性。HBc-VLPs是由HBc單體組成的二十面體顆粒，有兩種形態(tài)：由180個單體組成T=3型顆粒，直徑約30 nm；由240個單體組成T=4型顆粒，直徑約34 nm[30]，T代表二十面體一個面上劃分成小型等邊三角形數(shù)目[31]。在HBc-VLPs表面有刺突結(jié)構(gòu)，稱為免疫顯性區(qū)(MIR)，該區(qū)域作為遺傳操作的靶區(qū)域，可用計算機軟件預測的FMDV抗原表位替換或插入，供B淋巴細胞識別，誘導針對插入抗原表位的特異性體液免疫應答[32]。

FMDV抗原表位與HBc-VLPs融合的方法有4種：與HBc的N-末端結(jié)合；與HBc的C末端結(jié)合；插入至HBc的MIR區(qū)；通過連接子(linker)將HBc整合為二聚體，第1個HBc的MIR區(qū)空置，第2個MIR區(qū)插入表位。N-末端結(jié)合多肽受到長度限制，不能超過50 aa；C末端插入位置選擇在144、149、156位氨基酸，片段長度不能超過100 aa，否則會影響VLPs組裝[33]；而MIR區(qū)域是常用的外源序列插入?yún)^(qū)域，可選擇將外源肽插入至76～82 aa之間或完全替換MIR區(qū)域。HBc-VLPs既可以是胸腺依賴性抗原，又可以是非胸腺依賴性抗原[34]。作為胸腺依賴性抗原時，HBc所包含的Th細胞表位可被人體和小鼠識別，產(chǎn)生針對HBc和其包含外源抗原的免疫應答[35]。HBc可誘導Th細胞活化，并可產(chǎn)生對HBc和其攜帶FMDV抗原表位的適應性免疫應答，該特征使HBc成為理想的FMD疫苗載體[36]。

1987年，Clarke等[37]首次在《Nature》上發(fā)表使用HBc作為抗原表位載體，將FMDV VP1蛋白第141～160 aa表位多肽融合至HBc的N-末端，實驗表明，該段多肽的免疫原性明顯提高了。姜志剛將亞洲I、O型FMDV抗原表位插入在HBc的MIR區(qū)，利用真核細胞表達系統(tǒng)，形成嵌合型VLPs，其與相應的單抗有強的反應活性，說明抗原表位被成功地展示在HBc表面[38]。

5.3 PCV2-VLPs作為FMDV抗原表位的載體

豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是近年來新發(fā)現(xiàn)的引起豬繁殖障礙等多種疫病的一種重要病原。PCV2是圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus)的無囊膜的單股環(huán)狀DNA病毒，基因組全長約為1767 bp，病毒的衣殼蛋白含有一種衣殼蛋白ORF2，60分子的ORF2蛋白可自主組裝產(chǎn)生二十面體對稱的病毒衣殼結(jié)構(gòu)[39]。

將FMDV VP1 G-H環(huán)與異源病毒衣殼蛋白融合形成病毒粒子嵌合體[40]，有助于擴展病毒的抗原譜，提高病毒的免疫原性，將G-H Loop上的線性表位與誘導更強細胞免疫的載體蛋白結(jié)合可以誘導免疫動物產(chǎn)生高比率中和抗體，說明強免疫原性的載體蛋白可以增強針對線性表位的抗體應答[41]。李艷麗在PCV2衣殼蛋白長loop環(huán)CD/EF/GH內(nèi)嵌合FMDV G-H環(huán)，形成的VLPs有利于FMDV中和抗原表位的展示和中和抗體的產(chǎn)生[39]。曹軼梅等將FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1的抗原表位插入到PCV2衣殼蛋白的核定位信號序列中，在大腸桿菌中表達并獲得嵌合型VLPs，實驗結(jié)果表明，針對PCV2、FMDV均有良好的免疫反應，但是有一定的差異，說明PCV2衣殼蛋白的N-端不適合插入抗原表位遞呈在表面[42]。張飛雁等將O型FMDV中和表位插入到PCV2的CAP蛋白的C-端，ELISA、電鏡檢測均表明其成功構(gòu)建嵌合型VLPs，為研制基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)[43]。

5.4 PPV-VLPs作為FMDV抗原表位的載體

豬細小病毒(PPV)是細小病毒科(Parvoviridae)細小病毒屬(Parvovirus)的成員。PPV的主要結(jié)構(gòu)蛋白VP2在體外表達系統(tǒng)中能夠組裝成VLPs，在VP2蛋白N端連接外源細胞抗原表位能裝配成病毒樣顆粒，而且能檢測到針對該嵌入抗原的免疫應答，這些實驗說明PPV-VLPs可以作為外來抗原的載體，以此構(gòu)建出良好免疫原性和安全性的重組多價基因工程疫苗[44]。

Dalsqaard等在對犬細小病毒4個loop的插入研究中發(fā)現(xiàn)，loop2插入的重組體不僅能表達出最多的病毒樣顆粒，而且是唯一能引起免疫應答和中和反應的重組體[45]。潘群興等將O型FMDV上的抗原表位插入到PPV VP2蛋白不同Loop區(qū)，利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)獲得VLPs，Western Blotting檢測在有64 kDa大小有特異性條帶，電鏡觀察其組裝成了VLPs[46]。李文麗成功構(gòu)建了嵌合口蹄疫病毒抗原表位的PPV-VLPs，并利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)獲得了重組蛋白，用其免疫豚鼠獲得了低水平的FMDV抗體[47]。范朋舉將FMDV抗原表位插入了PPV-VP2蛋白表面的5個不同位點，尋找VP2蛋白上潛在的VLPs組裝非必需區(qū)，結(jié)果顯示在Loop1和C-端插入FMDV抗原表位后沒有形成VLPs，形成的VLPs使用ELISA檢測獲得了較高的抗體效價[1]。

6 影響VLPs展示FMDV抗原表位的因素

6.1 表達系統(tǒng)的選擇

目前，F(xiàn)MDV衣殼蛋白已成功在原核表達系統(tǒng)(大腸桿菌)、昆蟲細胞表達系統(tǒng)(桿狀病毒)和多種哺乳動物細胞表達系統(tǒng)(牛痘病毒、腺病毒)中重組表達并組裝成VLPs[7]。哺乳動物細胞表達系統(tǒng)與其他表達系統(tǒng)不同，其所指導的轉(zhuǎn)錄發(fā)生在胞漿中。牛痘病毒作為載體，能攜帶較大的外源DNA片段，進行翻譯后加工處理，指導蛋白質(zhì)形成正確的空間結(jié)構(gòu)，運輸和分泌表達的蛋白，但它表達重組蛋白的效率較低[19]。人腺病毒5型(Ad5)作為載體也應用廣泛，該病毒去除E1區(qū)缺少復制能力，可以減少野生毒株的負面影響；去除E3區(qū)可以增加病毒作為載體的攜帶量，主要的優(yōu)點是不與細胞基因組發(fā)生整合，可以感染處于不同時期的細胞，但是其作為載體還需要提升其蛋白表達量和延長表達時間[48-50]。昆蟲細胞表達系統(tǒng)能通過特定酶切位點將多個基因片段同時嵌入載體，獲得的重組桿粒能表達出異源性的多蛋白復合物，并可對多蛋白復合物進行翻譯后加工修飾，但其表達蛋白的時間較長，費用昂貴[51]。原核表達系統(tǒng)研究比較完善，其遺傳穩(wěn)定、繁殖周期短，目的蛋白表達水平和穩(wěn)定性高，但缺乏對蛋白質(zhì)的翻譯后加工及復性，形成不溶性蛋白[24]。為使目的蛋白可溶性表達，研究者們采用SUMO表達系統(tǒng)及標簽蛋白純化技術(shù)，設(shè)計帶有標簽的SUMO蛋白與目的蛋白融合。融合蛋白在大腸桿菌體內(nèi)可溶性表達后，SUMO蛋白酶特異性識別并切除帶有標簽的SUMO蛋白，可以還原目的蛋白天然構(gòu)象[26]。

6.2 體外組裝緩沖體系

選擇表達FMDV抗原表位的載體不同，體外組裝成VLPs的條件也會發(fā)生變化。有報道顯示，O型FMDV衣殼比其他血清型對酸更敏感，并且難以在低pH值的昆蟲細胞中組裝[52]。衣殼蛋白體外組裝傾向于疏水作用和共價鍵結(jié)合，高鹽和高溫條件都會使溶液疏水作用增強，但衣殼蛋白體外組裝是一個緩慢過程，高溫容易使蛋白降解不利于VLPs組裝[26]。溶液酸堿度影響蛋白質(zhì)分子表面電荷狀態(tài)，改變蛋白質(zhì)分子間及蛋白質(zhì)分子與溶液中的粒子之間相互作用力。依據(jù)衣殼蛋白等電點和溶液中的粒子強度調(diào)節(jié)溶液pH值，使衣殼蛋白以天然結(jié)構(gòu)存在并通過共價鍵或疏水作用有規(guī)則緩慢聚集成VLPs，中性偏堿或者堿性條件下FMDV-VLPs都能組裝[26]?？傮w來說，在pH值、溫度、緩沖體系離子強度的綜合影響下，才能使VLPs正確組裝。

6.3 FMDV抗原表位的插入位點和大小

對FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，G H loop突出于病毒衣殼表面，包含F(xiàn)MDV的主要抗原表位。研究表明，loop環(huán)中保守的RGD序列與FMDV侵入宿主細胞密切相關(guān)，且RGD序列兩側(cè)的殘基高度可變，可以作為外源肽段的插入位點。FMDV抗原表位可以與HBc的N-末端結(jié)合，與HBc的C-末端結(jié)合或插入(置換)到HBc的MIR區(qū)[53]。FMDV抗原表位可以插入PCV2衣殼蛋白長loop環(huán)CD/EF/GH內(nèi)形成嵌合VLPs[28]。PPV結(jié)構(gòu)蛋白VP2 loop2中插入FMDV抗原表位能表達出嵌合VLPs[33]。不同的插入位點會影響FMDV抗原表位在VLPs的展示，進而影響其免疫原性。而加入的FMDV抗原表位的大小可能會導致組裝效率改變，有可能還會影響VLPs的空間構(gòu)型，導致其不能正確組裝。研究表明，用完整VP1結(jié)構(gòu)蛋白組裝成的嵌合VLPs比單獨的VP1中和表位抗原性高許多，它能展示VP1上的所有優(yōu)勢抗原表位，空間構(gòu)象正確且B細胞表位完全暴露，組裝成的VLPs有可能正確呈現(xiàn)優(yōu)勢B細胞表位三級結(jié)構(gòu)，這樣就可能擁有與FMDV天然病毒粒子相近的免疫效果[12]。

7 討論

口蹄疫在數(shù)百年的流行中，不僅給世界各國帶來了巨大的經(jīng)濟損失，而且其間接損失是無法估量的。自從發(fā)現(xiàn)口蹄疫病毒粒子以后，抗口蹄疫的研究未曾停止，但是口蹄疫病原變異性極強，7個血清型之間沒有交叉免疫，同型內(nèi)不同病毒株的抗原性也不同，新毒株的不斷出現(xiàn)，使疫情不斷出現(xiàn)高潮，這使得口蹄疫難以得到有效的防治。傳統(tǒng)的疫苗為弱毒疫苗和滅活苗，這些疫苗存在散毒和變異的危險。隨著反向遺傳學的興起，新型疫苗的研制大步向前，有效解決了散毒和變異的危險，為制備聯(lián)苗和多價苗奠定了基礎(chǔ)。

VLPs不含病毒核酸，是制備病毒疫苗較為理想的載體，能夠?qū)⑼庠炊嚯谋砦徽故驹诒砻妫肰LPs制備FMD的亞單位疫苗具有廣闊的研究前景。目前研究較多的幾種VLPs，如FMDV-VLPs、HBc-VLPs、PCV2-VLPs和PPV-VLPs都成功作為載體將FMDV抗原表位展示在表面，并獲得了針對FMDV的保護力，VLPs既可以與其他危害嚴重的疾病一起制備為多價苗，也可以與同血清型病毒一起制備聯(lián)苗。但是常用的幾種表達系統(tǒng)組裝VLPs的效率低，形成VLPs的各個基因表達量不易控制，所以VLPs作為FMDV抗原表位載體的疫苗研制還需要更多的探索。