皮膚結(jié)核病研究進展

陳燕清 王洪生

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院皮膚病醫(yī)院分枝桿菌實驗室，南京 210042

結(jié)核病是傳染病中的“頭號殺手”。2016年全球仍有約1 040萬新發(fā)結(jié)核病例，其中我國新發(fā)病例89.5萬，排名第3［1］。皮膚結(jié)核占肺外結(jié)核病例的1%～2%［2-3］，但由于漏診誤診較多、缺乏病例上報系統(tǒng)，實際發(fā)生率可能更高。為了提高皮膚科醫(yī)師對該病的認識，我們對皮膚結(jié)核的病因、臨床表現(xiàn)、實驗室檢查和治療進展等進行綜述分析。

一、病因與發(fā)病機制

皮膚結(jié)核是結(jié)核分枝桿菌復合群引起的感染性皮膚病。結(jié)核桿菌復合群包括人型結(jié)核桿菌（M.tuberculosis）、牛型結(jié)核分枝桿菌（M.bovis）、卡介苗，牛型結(jié)核分枝桿菌的減毒株（M.bovisBCG）、非洲型分枝桿菌（M.africanum）、田鼠分枝桿菌（M.microti）、卡氏分枝桿菌（M.canettii）、M.pinnipedii、M.caprae和M.mungi。皮膚結(jié)核大多由人型結(jié)核桿菌感染引起，偶爾由牛型結(jié)核分枝桿菌、卡介苗引起［4］。最近分子流行病學分析發(fā)現(xiàn)，我國皮膚結(jié)核菌株基因分型與肺結(jié)核菌株大多數(shù)同屬于北京型，而在一些多位點數(shù)目可變串聯(lián)重復序列分析（mycobacterial interspersed repetitive unit-variable number tandem repeat typing，MIRUVNTR）位點如MIRU20、ETRC等與肺結(jié)核菌株有差異，尤其是皮膚結(jié)核菌株耐藥的發(fā)生率明顯少于肺結(jié)核菌株［5］。

結(jié)核桿菌侵入人體皮膚有不同的途徑。首先是外源性接種，結(jié)核桿菌經(jīng)由未曾感染過結(jié)核桿菌的宿主的皮膚損傷部位初次接種可引起原發(fā)性皮膚結(jié)核，而在曾感染過結(jié)核桿菌、存在較強免疫應(yīng)答的患者中再次接種結(jié)核桿菌可導致疣狀皮膚結(jié)核或?qū)こ＠钳彛?］。其次是內(nèi)源性感染，常來自于鄰近感染病灶的擴散，如淋巴結(jié)結(jié)核、骨結(jié)核的擴散引起的瘰癘性皮膚結(jié)核，也可由肺部、腸道、泌尿道感染的結(jié)核桿菌在排出過程中接種至腔口部位皮膚黏膜引起。此外，結(jié)核感染還可以通過淋巴、血液循環(huán)播散，因宿主免疫不同有不同的臨床表現(xiàn)，包括播散性粟粒性皮膚結(jié)核、尋常狼瘡、結(jié)核性樹膠腫、轉(zhuǎn)移性結(jié)核膿腫等［4］。在對結(jié)核桿菌有較強免疫反應(yīng)的患者，宿主對結(jié)核桿菌抗原成分的超敏反應(yīng)可引起不同的皮損，該組皮膚損害統(tǒng)稱為結(jié)核疹。結(jié)核疹患者結(jié)核菌素皮膚實驗或結(jié)核感染T細胞檢測（T-SPOT.TB）陽性，組織病理呈肉芽腫性炎癥改變，皮損處分枝桿菌培養(yǎng)陰性，系統(tǒng)抗結(jié)核治療有效，部分患者通過PCR技術(shù)可檢測到結(jié)核桿菌DNA［2，6-7］。

二、臨床表現(xiàn)

皮膚結(jié)核臨床表現(xiàn)多樣，典型皮膚結(jié)核包括尋常狼瘡、瘰癘性皮膚結(jié)核、疣狀皮膚結(jié)核、腔口部皮膚結(jié)核。結(jié)核疹最常見的3種類型是硬紅斑、丘疹壞死性結(jié)核疹和瘰癘性苔蘚［4，8-9］。一項多中心回顧性研究發(fā)現(xiàn)，我國皮膚結(jié)核和結(jié)核疹患者中硬紅斑最常見，其次依次為尋常狼瘡、疣狀皮膚結(jié)核、丘疹壞死性結(jié)核疹、瘰疬性皮膚結(jié)核等［10］。合并其他臟器結(jié)核的皮膚結(jié)核在我國約占所有皮膚結(jié)核病例的1/3，在國外兒童皮膚結(jié)核患者中的比例較成人患者高，為12.7%～53.4%［11-12］。

三、病理學檢查

各種類型皮膚結(jié)核的病理檢查均可見上皮樣細胞肉芽腫，可伴或不伴特征性干酪樣壞死和抗酸桿菌，與宿主的免疫反應(yīng)不同有關(guān)。急性期還可見中性粒細胞浸潤。需要與結(jié)節(jié)病、其他分枝桿菌感染、真菌感染、寄生蟲感染、異物反應(yīng)等肉芽腫性疾病鑒別。此外需注意皮膚結(jié)核也可以出現(xiàn)其他病理模式，如結(jié)節(jié)病樣肉芽腫、柵欄狀肉芽腫、非特異性慢性炎癥和脂膜炎等。結(jié)核疹中，瘰癘性苔蘚可見真皮淺層或毛囊周圍的結(jié)核樣結(jié)節(jié)，而丘疹壞死性結(jié)核疹較常見的為血管炎性改變，硬紅斑常呈小葉性脂膜炎模式［8，13］。

四、實驗室檢查

病原學檢測是確診重要的依據(jù)，但皮膚結(jié)核皮損中菌量通常較少，且細菌分布不均，增加了實驗室病原學檢查的難度。目前，皮膚結(jié)核的診斷技術(shù)在傳統(tǒng)的實驗室檢查方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合免疫學、分子生物學等已取得較大進展。

1.染色涂片鏡檢：對感染部位的組織液、引流液等進行抗酸染色，光鏡下觀察，若看到抗酸桿菌［14］，高度提示結(jié)核感染可能，但該方法敏感度低，不能區(qū)分結(jié)核桿菌與非結(jié)核分枝桿菌［15］。2012年世界衛(wèi)生組織推薦引入熒光染色鏡檢（light-emitting diode fluorescence microscopy），該方法敏感度提高，操作便捷，但特異度低，缺乏質(zhì)控過程，技術(shù)要求高等，限制了其廣泛應(yīng)用［16］。

2.結(jié)核菌培養(yǎng)：傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)基主要為Lowenstein-Jensen培養(yǎng)基（羅氏培養(yǎng)基）和Middlebrook 7H10培養(yǎng)基。不同實驗室的敏感度差異較大。結(jié)核菌在固體培養(yǎng)基上生長緩慢，需要4～12周［17］。應(yīng)用“改良羅氏培養(yǎng)基”［18］可獲得較高的敏感性。

基于液體培養(yǎng)基的方法目前已有應(yīng)用。結(jié)合改良Middlebrook7H9肉湯和熒光檢測技術(shù)的半自動培養(yǎng)系統(tǒng)BACTEC MGIT 960，是依賴一種氧敏感熒光化合物檢測分枝桿菌的生長：當接種分枝桿菌后，分枝桿菌生長消耗氧，即產(chǎn)生熒光反應(yīng)，產(chǎn)生橙色的熒光。該方法平均培養(yǎng)時間約為固體培養(yǎng)基的1/3，且相對固體培養(yǎng)基敏感度更高，利于后續(xù)的藥敏實驗［17-19］。

3.生化鑒定：通過分析分枝桿菌的形態(tài)、生長速度、色素形成、生長溫度及耐熱觸酶實驗和硝酸鹽還原實驗結(jié)果等可對分枝桿菌的群、種做初步鑒定，即“生化鑒定”。然而分枝桿菌各類種群的特性多有交叉或細微的改變，因此生化鑒定準確性受限，目前臨床應(yīng)用少。

4.免疫學檢測：結(jié)核菌素皮膚實驗通過測量結(jié)核菌素注射部位硬結(jié)的大小，評估機體對結(jié)核菌素抗原的遲發(fā)型超敏反應(yīng)，從而判斷結(jié)核感染狀態(tài)。該方法價格低廉，但結(jié)果判讀主觀性強，且受卡介苗接種、環(huán)境中多種非結(jié)核分枝桿菌的干擾，特異度較差；另外，其在免疫抑制人群中的敏感度較低［15］。

干擾素γ釋放實驗通過檢測外周血對早期分泌靶向抗原（ESAT-6，相對分子質(zhì)量6 000）和培養(yǎng)濾過蛋白（CFP-10，相對分子質(zhì)量10 000）肽庫的反應(yīng)，輔助檢測結(jié)核感染。由于ESAT-6與CFP-10的編碼基因區(qū)在卡介苗和大部分非結(jié)核分枝桿菌中缺失，因此其特異度較高［20］。目前用于臨床的有QuantiFERON-TB Gold In-Tube實驗和T-SPOT.TB實驗。T-SPOT.TB實驗在皮膚結(jié)核的診斷中敏感度較高，但與海魚分枝桿菌、戈爾登分枝桿菌等皮膚感染有交叉陽性，需要進一步鑒別［21-22］。

在結(jié)核菌素皮膚實驗基礎(chǔ)上改良設(shè)計的C-tb實驗利用ESAT-6和CFP-10的重組體進行皮內(nèi)注射，結(jié)合了結(jié)核菌素皮膚實驗的可操作性和干擾素γ釋放實驗高特異度的優(yōu)點，目前仍在臨床試驗階段［23］，有望將來應(yīng)用于皮膚結(jié)核診斷和監(jiān)測中。此外，研究發(fā)現(xiàn)重組多聚蛋白PstS1-LEP有潛力用于肺外結(jié)核的血清學檢測［24］。

5.PCR檢測：PCR檢測敏感度、準確度高，耗時短，是協(xié)助皮膚結(jié)核診斷的有力工具。目前用于檢測結(jié)核桿菌復合群的特異性靶DNA序列包括IS6110插入序列、hsp65編碼序列（Rv0440）、16S rRNA序列、85B蛋白編碼序列、MPB-64/MPT-64蛋白編碼序列（Rv1980c）、38 000蛋白編碼序列（Rv0934）、TRC4（保守重復序列）、GCRS（富GC重復序列）、hupB（Rv2986c）、dnaJ（Rv0352）、MTP-40蛋白編碼序列（Rv2351c）和PPE基因（Rv0355）等［25］。

IS6110序列在結(jié)核分枝桿菌復合群中以多拷貝形式存在，其應(yīng)用使PCR檢測敏感度升高，但有報道部分地區(qū)臨床菌株的IS6110序列拷貝數(shù)少，可導致假陰性結(jié)果［26-27］。分枝桿菌中16S rRNA、hsp65、rpoB、16S-23SrRNA間隔區(qū)序列有種內(nèi)多態(tài)、種間保守的特征，PCR擴增后進行酶切或測序?qū)﹁b別菌種有重要價值［27］。其中，16S rRNA鑒別能力較低，但相關(guān)數(shù)據(jù)庫最完整，對于少見的非結(jié)核分枝桿菌的鑒別意義較大；hsp65、rpoB、間隔區(qū)序列有更大的核苷酸多態(tài)性，有種、亞種特異性的等位基因存在，因此鑒別能力相對較強［28］。

與普通PCR相比，巢式PCR和多重PCR的引入提高了檢測的敏感度，目前在菌量少的皮膚結(jié)核中顯示出良好的應(yīng)用價值，并能鑒別結(jié)核分枝桿菌復合群內(nèi)的分枝桿菌［29-31］。此外，環(huán)介導等溫擴增法（LAMP）有簡單、快速、耐受PCR抑制劑的特點，其敏感度高于巢式PCR和多重PCR，而且其對設(shè)備要求低，LAMP有望成為取代PCR的檢測方法［32-34］。

近年新開發(fā)的The Xpert MTB/RIF實驗（Xpert實驗）是一種商品化的快速、自動化的分子檢測實驗，以結(jié)核桿菌rpoB基因序列為靶序列，通過半巢式實時PCR和分子信標技術(shù)檢測結(jié)核桿菌和利福平耐藥［35］。該方法能有效降低感染性氣溶膠形成、擴增污染菌的機會及人為操作誤差，且不需要配備多個實驗室操作間［35］。目前，Xpert實驗已被WHO許可用于肺結(jié)核的檢測，但對肺外結(jié)核不同的樣本類型診斷價值不一，且在皮膚結(jié)核中的應(yīng)用價值仍未證實［36］。

6.藥敏實驗與耐藥檢測：結(jié)核菌耐藥是結(jié)核病持續(xù)存在至今的原因之一。目前3.6%的新發(fā)結(jié)核病例和高達20%的繼發(fā)性結(jié)核病例已出現(xiàn)多重耐藥［1］。近年我國皮膚結(jié)核菌株耐藥基因篩查發(fā)現(xiàn)，分離自皮膚結(jié)核皮損中的結(jié)核菌株耐藥率較低［5］。

傳統(tǒng)的耐藥檢測方法包括比例法（proportion method）、臨界藥物濃度法（critical concentration method）和抗性比例法（resistance ratio method），都是基于檢測結(jié)核分枝桿菌在含已知濃度的藥物的培養(yǎng)基中生長的能力。這些方法準確可靠，但均步驟復雜，耗時很長，至少需要3周培養(yǎng)時間［36-37］?；谝后w培養(yǎng)基的藥敏實驗，結(jié)合放射定量的方法可有效檢測菌株對藥物的敏感度，且縮短了檢測時間［38-39］。BCTEC MGIT960系統(tǒng)就是基于液體培養(yǎng)基的一個商品化、自動化的系統(tǒng)，目前是WHO推薦的耐藥檢測方法。此外，一些非商品化的方法，如比色氧化還原指示劑法、硝酸鹽縮小實驗、顯微鏡觀察藥敏法等也被WHO推薦用于評估結(jié)核菌多重耐藥的風險［40-41］。

DNA測序技術(shù)的成熟和價格的顯著降低使耐藥基因檢測越來越多地用于臨床。目前研究陸續(xù)顯示，利福平耐藥與rpoB基因突變相關(guān)，吡嗪酰胺耐藥主要是由于pncA基因突變導致，異煙肼耐藥主要由katG、inhA和ahpC基因突變引起，鏈霉素耐藥主要與rrs和rpsL基因突變相關(guān)，乙胺丁醇耐藥主要是因為embB基因發(fā)生突變，克拉霉素耐藥主要是由于23sRNA肽酰轉(zhuǎn)移酶基因突變所致，喹諾酮類耐藥主要是由gyrA基因突變引起［41-42］。上文提到的Xpert實驗應(yīng)用于rpoB基因檢測評估利福平耐藥，已顯示出較好的價值，且可以2 h內(nèi)獲得結(jié)果［38］。

五、診斷與鑒別診斷

當出現(xiàn)慢性、非對稱分布的皮損時，需懷疑皮膚結(jié)核。臨床上一般需要與結(jié)節(jié)病、盤狀紅斑狼瘡、淋巴瘤以及其他感染性肉芽腫性疾病如真菌感染、梅毒樹膠腫等鑒別。硬紅斑需要與結(jié)節(jié)性紅斑、血管炎鑒別。丘疹壞死性結(jié)核疹需要和急性痘瘡樣苔蘚樣糠疹等鑒別。

皮膚結(jié)核的確診缺乏統(tǒng)一標準，目前需要綜合病史尤其是結(jié)核病史或接觸史、皮損特征、組織病理檢查、病原學檢測結(jié)果等進行診斷。皮膚結(jié)核臨床表現(xiàn)呈多樣化改變及實驗室檢查開展較為局限是目前皮膚結(jié)核誤診、延遲診斷的常見因素。因此提高對皮膚結(jié)核皮損特征的認識和實驗室檢測技術(shù)水平，是提高皮膚結(jié)核正確診斷率的重要策略。此外，對分枝桿菌培養(yǎng)陽性、抗酸染色陽性的病例，還需要與非結(jié)核分枝桿菌感染鑒別，可借助分子生物學方法進行實驗室診斷和鑒別診斷［9］。

六、治療

WHO推薦的標準的結(jié)核病治療方案包括2個月強化治療和4個月維持治療。強化治療包括乙胺丁醇、異煙肼、利福平、吡嗪酰胺四聯(lián)藥物治療，維持治療為異煙肼和利福平二聯(lián)藥物治療，如異煙肼可疑耐藥，則維持階段用吡嗪酰胺替代［2，43］。由于我國皮膚結(jié)核菌株對傳統(tǒng)抗結(jié)核藥物耐藥發(fā)生率低［5］，因此一旦確診皮膚結(jié)核便可及時給予上述標準抗結(jié)核治療方案，絕大部分患者均能獲得滿意療效。對于皮損泛發(fā)、合并骨結(jié)核等內(nèi)臟結(jié)核和HIV陽性的患者，維持治療時間需延長。藥物不良反應(yīng)導致治療中斷是影響療效的常見原因。治療期間，需注意予B族維生素預(yù)防異煙肼引起的周圍神經(jīng)病變，還需注意患者胃腸道、眼部、神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng)，且需監(jiān)測血常規(guī)、肝腎功能［43］。如對標準抗結(jié)核方案反應(yīng)欠佳或皮損進行性加重的患者，需要根據(jù)藥敏實驗結(jié)果調(diào)整治療方案。二線的抗結(jié)核藥物有阿米卡星、卡那霉素、鏈霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、加替沙星［9］。對于結(jié)核疹患者，需要查找內(nèi)臟結(jié)核，加用抗結(jié)核藥物如利福平［43］。

多重耐藥結(jié)核的流行是目前全球結(jié)核病疫情控制的嚴峻挑戰(zhàn)。對于多重耐藥結(jié)核，莫西沙星和左氧氟沙星被認為是安全有效的替代藥物，利奈唑胺（linezolid）可能對復發(fā)的多重耐藥結(jié)核有效［44］。此外新的有效抗結(jié)核藥物在不斷研發(fā)中，迪拉馬尼（delamanid）、貝達喹啉（bedaquiline）、PA-824已在進行III期臨床試驗，乙二胺同類物SQ-109和SQ-73正在進行Ⅱ期臨床試驗［44-45］。

七、總結(jié)

綜上所述，近年來皮膚結(jié)核在實驗室診斷技術(shù)、藥敏實驗和分子耐藥技術(shù)方面取得較大進展，以分子診斷技術(shù)和自動化系統(tǒng)的應(yīng)用較為突出。新的抗結(jié)核藥的研究也正向前推進，但目前主要的問題是皮膚科醫(yī)師對皮膚結(jié)核的臨床表現(xiàn)、病因與發(fā)病機制的熟悉程度較低，實驗室檢測技術(shù)特別是現(xiàn)代化診斷技術(shù)在很多地區(qū)開展較少，造成較多的誤診、誤治或延遲診療。未來，皮膚結(jié)核的流行病學研究有待加強，分子診斷技術(shù)、藥物研發(fā)將持續(xù)快速發(fā)展，皮膚結(jié)核將進入精準診斷與治療時代。