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    漆姑草多糖的提取及其含量的測定

    2015-12-16 08:59:48胡明華江忠遠
    遵義師范學(xué)院學(xué)報 2015年3期
    關(guān)鍵詞:無水乙醇蒸餾水苯酚

    胡明華,江忠遠,金 茜

    (遵義師范學(xué)院黔北特色資源應(yīng)用研究實驗室,貴州遵義563002)

    漆姑草多糖的提取及其含量的測定

    胡明華,江忠遠,金 茜

    (遵義師范學(xué)院黔北特色資源應(yīng)用研究實驗室,貴州遵義563002)

    探討了漆姑草多糖提取及含量測定的方法。采用蒸餾水溶解乙醇沉降法提取漆姑草中的多糖,用苯酚-硫酸法測定其含量。實驗結(jié)果表明:該方法簡單、方便、無污染,從漆姑草中提取的多糖含量高達20.19%。

    漆姑草;多糖;含量;水提醇沉法

    多糖物質(zhì)是很多中草藥的主要成分,生物活性較高,研究表明漆姑草水粗提物對人白血病K562細胞株具有較強的抑制作用[3],具有較高的開發(fā)利用價值,因此探討漆姑草多糖提取及含量測定的方法具有實際意義,可為漆姑草多糖藥應(yīng)用于臨床提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    漆姑草購于遵義市中醫(yī)院,并經(jīng)遵義市中醫(yī)院孔蕾藥劑師及遵義師范學(xué)院衛(wèi)生院趙淑敏副主任醫(yī)師鑒定。

    樣品經(jīng)低溫干燥后,用中藥粉碎機破碎,過70目篩,采用四分法縮分,存放于玻璃瓶中備用。

    1.2 儀器與試劑

    儀器:T6新世紀紫外-可見分光光度計(普析通用);RE-2000E旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);電子天平(北京多利斯儀器有限公司);HH-1恒溫水浴鍋(海浦東物理光學(xué)儀器廠)。

    試劑:葡萄糖、苯酚、濃硫酸、氯仿、無水乙醇、丙酮、正丁醇、石油醚(bp:30~60℃)、95%乙醇均為分析純。

    1.3 漆姑草多糖的提取方法

    準確稱取待用漆姑草70g于燒杯中,在25℃下用95%乙醇浸泡3次,每次浸泡時間為5h,95%乙醇用量依次為350mL、250mL、200mL。過濾,濾渣揮干溶媒后分三次加入蒸餾水400mL、250 mL、150 mL,于97℃水浴鍋中浸提,每次3h,合并濾液,減壓濃縮至150 mL。離心除去不溶物,過濾。濾液在攪拌下緩慢倒入95%乙醇至其醇濃度在80%左右,0~5℃靜置一天。過濾,分別用20mL無水乙醇、20mL丙酮沖洗沉淀,于40℃真空干燥一天,得灰色粗產(chǎn)物3.9446g。

    將上述粗產(chǎn)物用150mL二次蒸餾水溶解,離心分離上層清液。上層清液用Sevage試劑(氯仿:正丁醇=4:1)脫蛋白6次,直至無明顯蛋白層[4-5]。收集上層透明液體,水浴蒸發(fā)至20mL,加入40mL無水乙醇醇析多糖,過濾。分別用20mL無水乙醇、20mL丙酮分多次沖洗沉淀,將沉淀物于40℃真空干燥一天得漆姑草多糖1.4381g。

    1.4 葡萄糖標準溶液的配制

    準確稱取105℃恒重的葡萄糖10mg,定量轉(zhuǎn)移至250 mL棕色容量瓶中,使其濃度為,用于漆姑草多糖的測定。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 苯酚-硫酸液的配制與測定波長的選擇

    取分析純苯酚120g,在硫酸浴中蒸餾,收集180~182℃餾分。準確稱取5.0g苯酚蒸餾物,用少量二次蒸餾水溶解,轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶中定容,0~5℃冷藏備用。

    在10mL具塞刻度試管中分別加入1.0mL葡萄糖標準液、1.0mL苯酚儲備液,震蕩下加入5.0mL95%硫酸溶液,混勻后沸水浴加熱15min,冷至室溫,在450~510nm范圍內(nèi)進行光譜掃描,其最大吸收峰波長為490nm(見圖2)。

    圖1 最大吸收波長

    2.2 標準曲線的制作

    分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL葡萄糖標準液于7支10.0mL具塞刻度試管中,用二次蒸餾水稀釋至2.0mL,以2.0mL二次蒸餾水作空白試驗。在具塞刻度試管中加入1.0mL苯酚儲備液,搖勻,震蕩下加入5.0mL95%硫酸溶液,搖勻后沸水浴加熱15min。冷至室溫,于490nm下測定其吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標制作葡萄糖標準曲線,得標準曲線回歸方程:A=0.01708C-0.00663,R2=0.9990(見圖2)。

    圖2 葡萄糖標準曲線

    2.3 漆姑草多糖含量的測定

    準確稱取恒重后的漆姑草多糖10mg,用少量二次蒸餾水溶解后移入50mL棕色容量瓶中,定容。準確量取該溶液2mL,按照標準曲線測定方法測定其吸光度,用回歸方程計算測定溶液中葡萄糖的濃度。

    漆姑草多糖含量(%)=C×D×0.9/W×1000

    式中:W為多糖的質(zhì)量(mg),C為漆姑草多糖溶液中葡萄糖的濃度為漆姑草多糖的稀釋因素:D=2×100/0.2=1000,0.9為葡萄糖校正系數(shù)。

    由公式計算出提取的漆姑草多糖含量為20.19%。

    2.4 紫外吸收光譜

    取恒重后的漆姑草多糖l0mg,加適量二次蒸餾水溶解,用二次蒸餾水作空白,在200~600 nm范圍內(nèi)測定其吸收光譜(見圖4)。

    圖3 紫外吸收光譜

    由圖3可看出,漆姑草多糖水溶液在280nm處有微弱吸收,說明用Sevage法除蛋白后的多糖仍殘留有微量蛋白質(zhì)、多肽;但在260nm處無吸收現(xiàn)象,說明溶液中無核酸存在。

    2.5 漆姑草多糖的性質(zhì)

    漆姑草多糖恒重品為灰白色,無味,溶于熱水,不溶于試劑級的無水乙醇、環(huán)己烷、二甲苯、四氯化碳、環(huán)己酮等有機溶劑。Molish反應(yīng)有紫色環(huán)生成,苯酚-硫酸法呈陽性反應(yīng)。

    3 結(jié)論

    采用95%乙醇浸泡去除漆姑草中的生物堿、苷類、低聚糖等物質(zhì),水溶醇析法提取多糖,Sevage法除蛋白,經(jīng)分光光度法測定漆姑草多糖含量為20.19%。

    漆姑草多糖經(jīng)95%H2SO4酸化后水解為單糖,單糖脫水生成糠醛衍生物,最后和苯酚反應(yīng)生成有色物質(zhì),顯色反應(yīng)穩(wěn)定。用紫外可見分光光度法檢測漆姑草多糖的含量,方法簡單、可靠。

    [1]國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編寫組.中華本草[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1994.

    [2]黃筑艷,李焱.漆姑草揮發(fā)油成分的研究[J].長春師范學(xué)院學(xué)報,2006,25(5):58-60.

    [3]張素英,何林.漆姑草石油醚提取物化學(xué)成分分析及抗腫瘤活性篩選[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(28):15590-15591.

    [4]田衛(wèi).植物多糖的研究[D].蘭州:蘭州大學(xué),2007.

    [5]吳亞林.幾種天然生物活性多糖的化學(xué)研究[D].杭州:浙江大學(xué),2007.

    (責任編輯:朱 彬)

    On the Extraction and Determination of Polysaccharide in Sagina Japonica

    HU Ming-hua,JIANG Zhong-yuan,JIN Qian
    (The Application Research Lab for Featured Resources of Qianbei,Zunyi Normal College,Zunyi 563002,China)

    This paper gives a full account of the extraction and determination of polysaccharide in Sagina Japonica.The study adopts the distilled water to dissolve ethanol to extract polysaccharide and then use phenol-sulfuric aid method to determine its content.The experiment shows that this method is simple and convenient,and the content of the polysaccharide reaches 20.19%.

    Sagina Japonica;polysaccharide;content;water extraction and alcohol precipitation

    O629.12

    A

    1009-3583(2015)-0102-03

    2015-01-11

    胡明華,男,貴州遵義人,遵義師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院實驗師。

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