水產(chǎn)動(dòng)物腸道微生物的研究方法

郭倩倩，胡軍娜，魏金鎖，張 航

（1漯河市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，河南漯河462000；2漯河市源匯區(qū)農(nóng)林局，河南漯河462000；3漯河市植物保護(hù)植物檢疫站，河南漯河462000）

腸道微生物組成了生物個(gè)體內(nèi)部數(shù)量巨大且復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，其組成及活性的變化與相關(guān)環(huán)境因素、宿主協(xié)同發(fā)展，與宿主相關(guān)基因組、營(yíng)養(yǎng)吸收、代謝活動(dòng)、生活方法形成了復(fù)雜的相互作用關(guān)系[1]。魚(yú)類(lèi)體內(nèi)的腸道微生物在保持腸道健康、促使腸道發(fā)育、抵御病原入侵、改善機(jī)體能量吸收和脂肪代謝過(guò)程中起到了非常重要的作用。

本文就腸道微生物的影響因素、研究方法、尤其是目前最新最廣泛應(yīng)用的方法等作了綜述，以期為腸道微生物對(duì)魚(yú)類(lèi)的影響，及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應(yīng)用提供全面的理論知識(shí)和應(yīng)用信息。

1 影響水產(chǎn)動(dòng)物腸道微生物的因素

1.1 物種因素

多數(shù)研究表明，水產(chǎn)動(dòng)物腸道微生物主要包括需氧微生物、兼性厭氧微生物和專(zhuān)性厭氧微生物。細(xì)菌是魚(yú)類(lèi)腸道微生物最主要的種類(lèi)。不同魚(yú)類(lèi)腸道微生物的種類(lèi)和比例不同。在一些魚(yú)類(lèi)的腸道中，革蘭氏陰性細(xì)菌的數(shù)量居多，革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的數(shù)量較少。在海水魚(yú)類(lèi)的腸道中，無(wú)色桿菌屬（Achromobacter）、微球菌屬（Micrococcus）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、交替單胞菌屬（Alteromonas）、假單胞桿菌屬（Pseudomonas）、弧菌屬（Vibrio）、黃桿菌屬（Flavobacterium）為主要的細(xì)菌類(lèi)型[2]。在淡水魚(yú)類(lèi)的腸道中，假單胞桿菌屬（Pseudomonas）、擬桿菌屬A型（Bacteroidestype A）、氣單胞菌屬（Aeromonas）是首要的細(xì)菌類(lèi)型。除此之外，腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、梭狀桿菌屬（Clostridium）、微球菌屬（Micrococcus）、鄰單胞菌屬（Plesiomonas）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、鐮孢菌屬（Fusarium）和擬桿菌屬B型（Bacteroidestype B）在淡水魚(yú)類(lèi)的腸道中也存在。此外，乳酸菌在淡水魚(yú)類(lèi)和海水魚(yú)類(lèi)腸道中均有發(fā)現(xiàn)。某些酵母菌也在魚(yú)類(lèi)腸道中廣泛存在。在淡水魚(yú)類(lèi)和海水魚(yú)類(lèi)中均能發(fā)現(xiàn)紅酵母屬（Rhodotorula）中的酵母菌，并且發(fā)現(xiàn)的頻率較高。在海水魚(yú)類(lèi)中，皮狀絲孢酵母（Trichosporoncutaneum）、假絲酵母菌（Candida tropicalisare）、梅奇酵母菌（Metschnikowiazobelii）是腸道酵母菌中的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群。

1.2 生理因素

魚(yú)類(lèi)在生長(zhǎng)發(fā)育的各種階段，其體內(nèi)腸道微生物的群落構(gòu)成比例及數(shù)量都不相同。在對(duì)歐洲鰨（Soleasolea）的研究發(fā)現(xiàn)，處在仔魚(yú)期的歐洲鰨腸道微生物以產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、弧菌屬（Vibrio）、莫拉克氏菌屬（Moraxella）、非產(chǎn)氣單胞菌屬（Anaerogenicaeromonas）為主，但在稚魚(yú)期和成魚(yú)期則主要以黃桿菌屬（Flavobacterium）、莫拉克氏菌屬（Moraxella）、發(fā)光細(xì)菌（Photobacterium）、產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes）、葡萄球菌 （Staphylococcus）、微非產(chǎn)氣單胞菌屬（Anaerogenicaeromonas）、弧菌屬 （Vibrio）、球菌（Micrococcus）為主。Verner-Jeffreys等對(duì)大西洋大比目魚(yú)（Hippoglossus hippoglossus）的研究也有相似的報(bào)道[2]。

1.3 環(huán)境因素

眾所周知，水體中含有大量的微生物，而魚(yú)類(lèi)生活在水環(huán)境中。從仔魚(yú)孵化開(kāi)始，微生物便以不同形式由水體進(jìn)入腸道，其中適應(yīng)腸道內(nèi)環(huán)境的微生物便演變?yōu)槟c道中的常駐菌群。環(huán)境中的眾多因子影響?hù)~(yú)類(lèi)腸道微生物的組成和數(shù)量。季節(jié)的變化會(huì)引起魚(yú)類(lèi)腸道微生物的變化。在對(duì)奧尼羅非魚(yú)（Oreochromisniloticus×Oreochromisaureus）腸道中細(xì)菌含量測(cè)定的研究中發(fā)現(xiàn)，在夏、秋、冬三個(gè)季節(jié)中腸道內(nèi)細(xì)菌數(shù)量的變化較大。水溫的高低也會(huì)影響?hù)~(yú)類(lèi)腸道微生物結(jié)構(gòu)組成[3]。Leamaster等[4]在紅羅非魚(yú)（Oreochromismossambicus）的研究中發(fā)現(xiàn)，水體溫度在18℃時(shí)，其腸道微生物的數(shù)量明顯多于26℃時(shí)。此外，水體中殘留的殺蟲(chóng)劑、農(nóng)藥、抗生素等也會(huì)影響?hù)~(yú)類(lèi)腸道微生物菌群。

1.4 營(yíng)養(yǎng)與飼料因素

飼料是促進(jìn)魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)的最直接營(yíng)養(yǎng)，它的組成成分會(huì)影響?hù)~(yú)類(lèi)腸道微生物的組成。研究表明，在仔魚(yú)階段、稚魚(yú)階段和幼魚(yú)階段，魚(yú)類(lèi)體內(nèi)的腸道微生物菌群會(huì)根據(jù)飼料組成物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分的改變發(fā)生相對(duì)較快的變化。飼料中添加相應(yīng)的添加劑（如益生菌或益生元等），將會(huì)對(duì)調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的平衡狀態(tài)，改善腸道菌群構(gòu)成比例產(chǎn)生積極的作用。Ringφ等[5]研究表明，飼喂標(biāo)準(zhǔn)大豆蛋白和發(fā)酵大豆蛋白的大西洋鱈魚(yú)，魚(yú)體腸道中細(xì)菌以嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）和肉桿菌屬（Carnobacterium）為主。而如果飼喂魚(yú)粉，魚(yú)體腸道中細(xì)菌則以肉桿菌屬（Carnobacterium）和環(huán)絲菌屬（Brochothrix）為主。

2 腸道微生物的研究方法

2.1 純培養(yǎng)方法

早期對(duì)人類(lèi)腸道微生物的研究主要基于純培養(yǎng)研究方法，研究者通過(guò)模擬腸道內(nèi)厭氧環(huán)境，利用純培養(yǎng)技術(shù)，以糞便、腸粘膜或者腸道內(nèi)容物為研究對(duì)象，對(duì)腸道中的微生物類(lèi)群進(jìn)行定性定量分析鑒定。由于腸道內(nèi)存在的細(xì)菌種類(lèi)較多，腸道內(nèi)環(huán)境中包含的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較為豐富，且需嚴(yán)格厭氧條件，因此，用純培養(yǎng)方法來(lái)定性定量檢測(cè)腸道微生物菌群具有局限性，但獲得的純培養(yǎng)微生物對(duì)于幫助我們了解腸道微生物的結(jié)構(gòu)和功能意義重大。通過(guò)分離培養(yǎng)獲得腸道中微生物的純培養(yǎng)物，不僅有助于幫助我們研究腸道微生物在不同生長(zhǎng)條件下的基因表達(dá)情況和代謝產(chǎn)物變化情況，更有助于幫助我們了解腸道微生物間的相互作用。此外，腸道微生物純培養(yǎng)還能夠?yàn)槲覀兩钊腙U明致病菌的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，目前創(chuàng)建了“序列引導(dǎo)”分離方法，即首先利用分子技術(shù)對(duì)腸道菌群組成進(jìn)行分析，之后根據(jù)分析結(jié)果選擇分離特定物種，通過(guò)基因組測(cè)序等方法，有針對(duì)性地對(duì)照分析腸道菌群與某些生理狀態(tài)相對(duì)應(yīng)的功能。

2.2 依賴(lài)指紋圖譜的分子生態(tài)學(xué)研究方法

基于純培養(yǎng)的微生物菌落結(jié)構(gòu)分析方法不能全面了解腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)、功能和多樣性。因?yàn)闄C(jī)體腸道內(nèi)嚴(yán)格的厭氧環(huán)境很難模擬，加上某些微生物需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較為特殊，絕大多數(shù)的腸道微生物菌株不能通過(guò)純培養(yǎng)方法分離得到。近幾年來(lái)，分子生態(tài)學(xué)發(fā)展迅速，與傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法不同，微生物分子生態(tài)學(xué)方法是針對(duì)群落當(dāng)中所有DNA物質(zhì)進(jìn)行分析，能夠較為全面地分析樣品中微生物群落組成和功能的多樣性。該方法無(wú)需進(jìn)行純培養(yǎng)分離，速度相對(duì)較快，結(jié)果也較為客觀。

在微生物分子技術(shù)分析中，最為廣泛的分子標(biāo)記物是核糖體小亞基RNA基因（16S rRNA或18S rRNA基因）。在微生物分子生態(tài)學(xué)應(yīng)用中，主要用于微生物群落組成結(jié)構(gòu)及物種多樣性分析，并對(duì)菌群功能進(jìn)行預(yù)測(cè)。除此之外，利用特異性引物分析功能基因也是常用的方法。微生物分子生態(tài)學(xué)常用的技術(shù)主要有指紋圖譜技術(shù)和基于測(cè)序的技術(shù)。

指紋圖譜技術(shù)是通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得代表微生物群落的總體核酸分子，通過(guò)不同形式的凝膠電泳，分離不同核酸分子。該技術(shù)可以快速直觀地展現(xiàn)樣本中微生物群落的概況，適合同一樣本的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和不同樣本間的橫向比較。當(dāng)前應(yīng)用較為廣泛的指紋圖譜技術(shù)主要包含了變性梯度凝膠電泳/溫度梯度凝膠電泳（DGGE/TGGE）、末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（T-RFLP）和ERIC-PCR指紋圖譜。變性/溫度梯度凝膠電泳技術(shù)（DGGE/TGGE），是指擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度一致但序列各異的雙鏈DNA分子在發(fā)生解鏈的變化過(guò)程中，所需的溫度或變性劑梯度不同。在電泳時(shí)，序列不一致的DNA會(huì)在遷移到不同的位置時(shí)發(fā)生解鏈，從而使不同序列的DNA分子在電泳過(guò)程中分開(kāi)。Muyzer等首次利用變性梯度凝膠電泳研究微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性[6]。之后，研究學(xué)者將該技術(shù)應(yīng)用到人體腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的研究中[7]。隨后，張學(xué)禮等人對(duì)該技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，他們通過(guò)利用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳去除由于PCR不完全造成的單鏈DNA污染，以此來(lái)提高變性/溫度梯度凝膠電泳圖譜的種類(lèi)及對(duì)條帶回收測(cè)序的準(zhǔn)確性[8]。末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（T-RFLP）是通過(guò)限制性酶切特定片斷后，在片段末端加上熒光標(biāo)記來(lái)區(qū)別不同物種的一種方法。該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于土壤、水體、腸道菌群等復(fù)雜的環(huán)境微生物群落研究中。此外，PCR-ERIC指紋圖譜技術(shù)被應(yīng)用于環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)的分析中。研究表明，針對(duì)不同的細(xì)菌類(lèi)型，ERIC序列具有不同的數(shù)量以及長(zhǎng)度，甚至在有的DNA中不需要ERIC序列的存在，使用ERIC-PCR引物也能夠進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)而得到相對(duì)穩(wěn)定的指紋圖譜。鑒于該方法相對(duì)穩(wěn)定，獲得條帶的多態(tài)性較高，且操作簡(jiǎn)單，因此常被用以鑒定不同細(xì)菌，反映群落結(jié)構(gòu)間的變化。

2.3 依賴(lài)測(cè)序的分子生態(tài)學(xué)研究方法

隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，微生物結(jié)構(gòu)和功能的研究進(jìn)入到一個(gè)革命性的時(shí)代。DNA測(cè)序技術(shù)可以直接獲取樣品中核酸物質(zhì)的序列信息，然后通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育地位分析來(lái)判斷微生物群落組成的豐富度和多樣性，進(jìn)而對(duì)各個(gè)物種的生物功能進(jìn)行預(yù)測(cè)。微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性研究中比較常見(jiàn)的手段是16S rRNA基因克隆文庫(kù)，該技術(shù)利用克隆文庫(kù)獲得群落中每一條基因的系統(tǒng)發(fā)育地位，進(jìn)而獲取微生物群落組成及多樣性的信息。Eckburg等人利用16S rRNA基因克隆文庫(kù)方法系統(tǒng)分析了腸道內(nèi)粘膜以及糞便中的微生物菌群組成，全面深入地闡明了腸道菌群結(jié)構(gòu)[9]。此外，某些專(zhuān)門(mén)針對(duì)腸道微生物特殊功能類(lèi)群特異性克隆文庫(kù)的方法也隨之發(fā)展起來(lái)，如利用Clostridium leptum類(lèi)群和Clostridium coccoides類(lèi)群特異性的引物來(lái)構(gòu)建類(lèi)群特異性的克隆文庫(kù)，分析腸道內(nèi)C.leptum類(lèi)群和C.coccoides類(lèi)群的多樣性[10，11]。

3 高通量測(cè)序在魚(yú)類(lèi)腸道菌群研究中的應(yīng)用

當(dāng)前，隨著國(guó)內(nèi)外高通量測(cè)序技術(shù)在人類(lèi)及畜禽動(dòng)物腸道微生物研究中的廣泛應(yīng)用，使用該技術(shù)研究魚(yú)類(lèi)腸道微生物菌群組成也成為熱點(diǎn)。通過(guò)對(duì)高通量技術(shù)的使用，全方位認(rèn)識(shí)對(duì)魚(yú)類(lèi)體內(nèi)腸道微生物菌群組成比例的影響因素，對(duì)改善調(diào)節(jié)其消化道菌群組成、提高魚(yú)類(lèi)的生產(chǎn)能力和飼料利用率、降低有害菌群對(duì)魚(yú)類(lèi)的侵害起到十分重要的作用。李彤華等人采用454高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)養(yǎng)殖于同一池塘的鯽魚(yú) （Carassiuscuvieri）、草魚(yú)（Ctenopharynodonidellus）和鳙（Hypophthalmichthysnobilis）的腸道內(nèi)容物、腸上皮粘膜和相關(guān)環(huán)境樣品進(jìn)行研究，分析樣品中微生物菌群結(jié)構(gòu)組成及多樣性。隨后通過(guò)Weighted-UniFra距離進(jìn)行熱圖分析（Heatmap analysis）和主成分分析（Principal coordinate analysis），發(fā)現(xiàn)不同魚(yú)類(lèi)的腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)組成并非是對(duì)其生存環(huán)境中的微生物的簡(jiǎn)單反映，而是來(lái)自腸道內(nèi)部微生物菌群特異性選擇壓力（尤其取決于種特異性的免疫和代謝）[12]。張皓等人利用高通量測(cè)序技術(shù)研究了鯉科魚(yú)（鰱、鳙、鯽、鯉、草魚(yú)、青魚(yú)）、南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘中水體、底泥及水產(chǎn)動(dòng)物腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的組成和多樣性，探究水體、底泥中的微生物群落與環(huán)境因子的互作關(guān)系。研究結(jié)果不僅加深了人們對(duì)養(yǎng)殖水體、底泥和水產(chǎn)動(dòng)物腸道內(nèi)微生物群落間相互影響的理解，也為進(jìn)一步從調(diào)控環(huán)境因子著手來(lái)改善養(yǎng)殖環(huán)境中微生物的群落結(jié)構(gòu)、抑制病原微生物、減少南美白對(duì)蝦和常規(guī)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的傳染病發(fā)生提供理論依據(jù)。職通瑞利用16S rRNA測(cè)序技術(shù)，通過(guò)研究和分析凡納濱對(duì)蝦腸道內(nèi)的微生物群落，向人們揭示健康凡納濱對(duì)蝦腸道內(nèi)的微生物組成，闡明了美人魚(yú)發(fā)光桿菌（Litopenaeusvannamei）和對(duì)蝦白斑綜合癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV）對(duì)腸道內(nèi)微生物組成的影響，為人們更好地認(rèn)識(shí)和使用微生態(tài)制劑提供理論依據(jù)。

4 小結(jié)

腸道微生物與魚(yú)類(lèi)的生命活動(dòng)具有非常緊密的關(guān)系。深入研究水產(chǎn)動(dòng)物腸道微生物的組成、功能及作用機(jī)制，探究新的研究方法與思路，將為維持魚(yú)類(lèi)腸道健康、提升水產(chǎn)動(dòng)物健康養(yǎng)殖技術(shù)水平提供理論依據(jù)，為促進(jìn)魚(yú)類(lèi)的健康養(yǎng)殖和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展奠定基礎(chǔ)。