漁用口服疫苗在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用

（河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453007）

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，我國(guó)進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)養(yǎng)殖的種類已達(dá)60多種，據(jù)《中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒（2018）》測(cè)算，2017年我國(guó)水產(chǎn)品總產(chǎn)量6445.3萬(wàn)t。據(jù)FAO（Food and Agriculture Organization of the United Nation）統(tǒng)計(jì)，近十年我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖總產(chǎn)量連續(xù)以5%-6%的增長(zhǎng)速率穩(wěn)步增長(zhǎng)[1-2]，且我國(guó)已成為世界上最大的水產(chǎn)品生產(chǎn)、消費(fèi)和進(jìn)出口國(guó)家。與此同時(shí)，隨著集約化養(yǎng)殖的程度不斷提高，魚(yú)類病害也急劇增加，給我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大損失。目前，國(guó)內(nèi)水產(chǎn)動(dòng)物疾病的防治仍主要依賴抗生素和化學(xué)類藥物的使用，藥物濫用給水產(chǎn)品質(zhì)量安全及水環(huán)境保護(hù)帶來(lái)嚴(yán)重的風(fēng)險(xiǎn)。漁用疫苗可有效防控水產(chǎn)動(dòng)物疾病發(fā)生，可減少抗生素和化學(xué)類藥物的濫用。其中漁用口服疫苗與其他免疫方式相比，具有能降低對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的機(jī)械損傷、節(jié)省人力物力、降低養(yǎng)殖成本等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景較好。

1 口服疫苗特點(diǎn)

漁用口服疫苗是滅活疫苗、減毒活疫苗和核酸疫苗等疫苗通過(guò)包封或生物載體等技術(shù)處理之后，以口服方式對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物進(jìn)行免疫接種的一類疫苗統(tǒng)稱?？诜绞竭m用于不同規(guī)格的水產(chǎn)動(dòng)物，不受其大小和年齡的限制，因此不易引起機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。與注射免疫相比，能減少對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物造成的機(jī)械損傷，可在一定程度上大大節(jié)省人力物力、提高免疫效率，從而降低養(yǎng)殖成本，同時(shí)也滿足了動(dòng)物福利的要求。目前，國(guó)內(nèi)外水產(chǎn)養(yǎng)殖大部分朝著集約化和工廠化方向發(fā)展，與其他免疫接種方法相比，口服法免疫更適合大規(guī)模養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物的免疫，尤其適合于多次重復(fù)免疫操作[3]。但目前漁用口服疫苗的研發(fā)和應(yīng)用還不夠廣泛，其制約因素主要是疫苗在胃和腸道中受到胃酸和消化酶作用，免疫原性易遭到不同程度的破壞，使其不能在后腸引發(fā)相應(yīng)的粘膜免疫及系統(tǒng)免疫反應(yīng)，從而不能引起足夠的免疫原性，除此之外還可能誘導(dǎo)免疫耐受性。

2 口服疫苗免疫機(jī)理

魚(yú)類口服疫苗引起的免疫主要以粘膜免疫為主，與哺乳動(dòng)物相比，魚(yú)類胃腸道粘膜免疫和抗原攝取的研究還處于起步階段[4]，根據(jù)腸上皮細(xì)胞形態(tài)，魚(yú)類腸道一般可分為三段，前段占腸總長(zhǎng)度的60%-75%，含有脂類吸收的腸上皮細(xì)胞；中段占腸總長(zhǎng)度的20%-25%，腸細(xì)胞特征是核外有大的液泡，并且胞飲活性高；后段占腸總長(zhǎng)度的5%-15%，后腸上皮細(xì)胞具有滲透調(diào)節(jié)的功能，且有短微絨毛[5]，但各段腸道中淋巴細(xì)胞亞群和分泌性免疫球蛋白分布的研究報(bào)道較少。

哺乳動(dòng)物腸壁內(nèi)存在著大量淋巴組織，構(gòu)成腸道免疫的第1道防線。腸相關(guān)淋巴組織、小腸的派氏集合淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、闌尾、氣管相關(guān)淋巴組織、淚腺、腮腺、扁桃體和乳腺等相互連接，形成共同粘膜免疫系統(tǒng)，是抗原進(jìn)入粘膜并產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的主要部位。在粘膜免疫中發(fā)揮重要作用的SIgA形成局部粘膜區(qū)域，隨著細(xì)菌入侵，當(dāng)上皮表面免疫活性細(xì)胞受到細(xì)菌粘附素刺激時(shí)，粘膜局部便產(chǎn)生SIgA，阻止腸道微生物及其毒素分子對(duì)胃腸粘膜的攻擊[6]。然而，目前還不清楚魚(yú)類是否擁有同樣作用的共同粘膜免疫系統(tǒng)，但現(xiàn)已證實(shí)，魚(yú)類后段腸細(xì)胞的胞飲能力與哺乳動(dòng)物腸道的M細(xì)胞相似，能吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)可溶性或顆粒性抗原，并可迅速將抗原釋放到細(xì)胞間隙，在此處當(dāng)抗原遇到上皮內(nèi)巨噬細(xì)胞時(shí)，巨噬細(xì)胞在細(xì)胞膜上顯示抗原決定簇，有抗原呈遞功能[7,8]。

硬骨魚(yú)中粘膜相關(guān)淋巴組織主要分布于鰓、皮膚、腸道和鼻咽等部位，其中由若干種淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和漿細(xì)胞組成腸道相關(guān)淋巴組織，B細(xì)胞是該粘膜相關(guān)免疫系統(tǒng)的主要應(yīng)答者之一，這些淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白（如IgM和IgT）是抵御病原體的關(guān)鍵防線[9]。目前關(guān)于如何減少胃腸道對(duì)口服疫苗的降解和提高免疫反應(yīng)性，使口服疫苗高效應(yīng)用是研究的熱點(diǎn)。

3 口服疫苗種類及其應(yīng)用

口服疫苗可有效激發(fā)腸粘膜免疫，給藥途徑簡(jiǎn)單、安全，且種類繁多，按疫苗類型主要包括菌苗、病毒疫苗、蛋白質(zhì)亞單位疫苗、合成肽疫苗、基因缺失疫苗、DNA疫苗及轉(zhuǎn)基因植物疫苗等[10]；通過(guò)不同處理包封方式還可分為聚合微球體和生物被膜制備的佐劑疫苗以及生物載體疫苗。聚合微球體的包裹材料主要有海藻酸鹽、殼聚糖和葡聚糖等，生物被膜有細(xì)胞外聚集物質(zhì)、滅活菌體的聚乳酸-乙酸共聚物和復(fù)乳揮發(fā)法制備的含嗜水氣單胞菌被膜等，生物載體有昆蟲(chóng)（鹵蟲(chóng)幼體、甜菜夜蛾、蠶蛹等），益生菌（枯草芽孢桿菌、酵母菌等），植物（衣藻、魚(yú)腥藻和馬鈴薯等）及病毒等。下面就常見(jiàn)口服疫苗進(jìn)行介紹。

3.1 微囊疫苗

可生物降解微球作為口服疫苗的新型載體，因其具有降解速度緩慢且可以控釋、增強(qiáng)免疫應(yīng)答、減少接種次數(shù)、口服免疫可減少消化液破壞等優(yōu)點(diǎn)而備受青睞[11]，隨著微囊疫苗工藝的不斷成熟，漁用囊膜疫苗已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)取得了較好的免疫效果。1997年Joosten等[12]研制了虹鱒微囊化口服疫苗，首次將疫苗微囊化應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖。高銘蔚等[13]用1%福爾馬林滅活無(wú)乳鏈球菌，由聚乳酸一羥基乙酸[poly(D,L-lactic-CO-glycolic)acid，PLGA]包裹制備口服疫苗，采用口服法免疫尼羅羅非魚(yú)，研究表明，與陽(yáng)性對(duì)照相比，其抗體可在高水平維持較長(zhǎng)時(shí)間，可見(jiàn)PLGA微球口服疫苗具有控制疫苗釋放，延長(zhǎng)免疫的作用，從而增強(qiáng)羅非魚(yú)對(duì)病菌的抵抗能力。李新華等[1 4]用0.5%福爾馬林滅活嗜水氣單胞菌，由海藻酸鈉包裹制備的疫苗口服免疫銀鯽，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組相對(duì)百分比成活率為61.1%，高于對(duì)照組的50%，這說(shuō)明微囊疫苗可以提高免疫保護(hù)性。此外，由海藻酸鹽包裹的傳染性胰腺壞死病毒（IPNV）的DNA疫苗口服免疫虹鱒和褐鱒，攻毒后相對(duì)百分比成活率可達(dá)到80%[15]，但是Embregts等[16]用海藻酸鈉包封的鯉春病毒血癥病毒DNA疫苗和基于昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)的亞單位疫苗口服免疫鯉，均未達(dá)到預(yù)期保護(hù)率，與對(duì)照組相比甚至加速了鯉的死亡，分析原因可能是海藻酸鹽不一定是通用的封裝基質(zhì)，也可能是劑量和接種程序不適宜，綜上所述，口服疫苗所需包封基質(zhì)應(yīng)針對(duì)魚(yú)的種類和特定病原體進(jìn)行調(diào)整和應(yīng)用。

3.2 生物載體疫苗

生物載體疫苗又稱活載體疫苗，是利用基因工程技術(shù)將外源抗原在微生物或動(dòng)植物載體中表達(dá)的疫苗。生物載體疫苗具有免疫效力高、成本低及安全性好等優(yōu)點(diǎn)，是未來(lái)疫苗研制與開(kāi)發(fā)最有潛力的發(fā)展方向[17]。此類疫苗技術(shù)主要用于人類和畜禽類疫苗開(kāi)發(fā)，在漁業(yè)上應(yīng)用并不成熟。目前，細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和植物[18]等生物載體已被用于表達(dá)外源蛋白。

Han等[19]針對(duì)鯽嗜水氣單胞菌病，選用嗜水氣單胞菌的OmpG作為抗原蛋白，在生物載體釀酒酵母中表達(dá)，口服免疫鯽后，通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)到鯽腸道粘膜表達(dá)抗原蛋白基因，且特異性抗體顯著增加，累計(jì)死亡率為46.7%，相比陰性對(duì)照組有了明顯的下降。Seong等[18]將神經(jīng)壞死病毒的衣殼蛋白作為抗原蛋白在煙草葉綠體中成功表達(dá)，對(duì)小鼠和斑馬魚(yú)進(jìn)行口服免疫，通過(guò)ELISA的方法在小鼠和斑馬魚(yú)體中檢測(cè)出特異性抗體，且加免疫佐劑組表達(dá)顯著，就斑馬魚(yú)而言，累計(jì)死亡率顯著降低。Lin[20]等利用鹵蟲(chóng)傳遞含有表達(dá)神經(jīng)壞死病毒衣殼蛋白的重組大腸桿菌，對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)進(jìn)行口服免疫，通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)到斑馬魚(yú)后腸中有此抗原蛋白基因的表達(dá)，且特異性抗體顯著增加，免疫保護(hù)率達(dá)到69.5%。綜上所述，生物載體疫苗比其它疫苗，在表達(dá)外源抗原成分時(shí)有更多選擇性，并且在抗原呈遞方面有效性較高[21]，但通過(guò)生物載體表達(dá)的蛋白一般效率不高，且口服接種保護(hù)率相比注射等方式較低，因此，篩選高效表達(dá)的生物載體，探索提高口服疫苗免疫保護(hù)率的方法和技術(shù)將是未來(lái)研究的重要方向。

4 總結(jié)與展望

漁用口服疫苗通過(guò)口服進(jìn)行免疫是一種較為方便的免疫方式，且不受接種對(duì)象規(guī)格大小、口服疫苗種類、接種時(shí)間和次數(shù)等限制。漁用口服疫苗在水產(chǎn)養(yǎng)殖中有著廣闊的應(yīng)用前景，口服疫苗不僅有效避免了由于注射引起的機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)和損傷，而且可以減少人力物力，降低養(yǎng)殖成本，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中易于推廣和應(yīng)用?？诜呙缭谀c道中主要以黏膜免疫為主，但目前其免疫機(jī)理并不清楚，今后應(yīng)加強(qiáng)口服疫苗引起的黏膜免疫效應(yīng)及機(jī)理研究。此外，口服免疫保護(hù)率較低，口服疫苗遞送系統(tǒng)研究處于初級(jí)階段，口服疫苗的高效導(dǎo)入和提高免疫效果應(yīng)是今后的研究重點(diǎn)。因此，今后應(yīng)從基礎(chǔ)研究和應(yīng)用開(kāi)發(fā)兩方面著手，立足漁業(yè)生產(chǎn)中魚(yú)病防控，加強(qiáng)漁用口服疫苗的研發(fā)和應(yīng)用，提高口服疫苗的免疫保護(hù)率，以更好地應(yīng)用于漁業(yè)生產(chǎn)，防控魚(yú)類疾病發(fā)生，對(duì)于水產(chǎn)健康養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展將具有重要意義。