提高和牛冷凍精液生產(chǎn)質(zhì)量關(guān)鍵措施

丁麗艷 韓永勝 李同豹 李平

（黑龍江省畜牧研究所150000）

1 和牛種子公牛的選擇

種子公牛的質(zhì)量是生產(chǎn)高質(zhì)量精液的前提和保障，對(duì)牛群的發(fā)展及品種改良起著重要作用。選擇依據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)主要包括系譜、自身、后裔選擇。根據(jù)系譜選擇其父母代繁殖性能、各階段體重與增重、飼料報(bào)酬及與肉用性能有關(guān)的外貌表現(xiàn)都良好的后代，并經(jīng)過(guò)后裔測(cè)定合格留作種用。

對(duì)和牛種公牛自身的選擇，包括生長(zhǎng)發(fā)育、體質(zhì)外貌、體尺體重、早熟性及精液質(zhì)量等性狀。要求全身結(jié)構(gòu)勻稱，健康無(wú)疾病，體質(zhì)強(qiáng)壯，精神狀態(tài)好，毛皮光滑，體況良好，膘情適宜，雄性特征明顯，生殖器官發(fā)育良好，睪丸大小正常，有彈性。當(dāng)小牛長(zhǎng)到1歲以上就可以直接測(cè)定其某些經(jīng)濟(jì)性狀，如12月齡以上的活重、育肥期增生效率等。選擇適宜于遺傳力高的性狀。精液質(zhì)量好，正常情況下鮮精活力不低于0.7，畸形精子不高于20%。

2 種公牛的培育

2.1 飼養(yǎng)

種公牛的繁殖性能、精液質(zhì)量與飼料有密切相關(guān)。種公牛的飼料要求必須營(yíng)養(yǎng)全價(jià)、種類多樣、搭配合理、適口性好、易于消化。飼喂種公牛時(shí)要多飼喂高蛋白和青干飼料，少喂能量飼料和多汁飼料。飼料中除了一些基礎(chǔ)類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還要注意其他一些微量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量，如VA、VE、鋅、銅、鐵、硒等的缺乏會(huì)導(dǎo)致精子數(shù)量減少、活力降低、畸形率增加，受胎率降低。除了飼料營(yíng)養(yǎng)外，還要保證飼料品質(zhì)，嚴(yán)禁飼喂發(fā)霉變質(zhì)的飼料。由于青貯飼料飼喂過(guò)量會(huì)影響種公牛精液的品質(zhì)，飼喂時(shí)要掌握好飼喂量，一般每天保證每天飼喂10kg以下。

非采精期和采精期種公牛的飼養(yǎng)方法和營(yíng)養(yǎng)需求不同。種公牛在非采精期營(yíng)養(yǎng)的供給主要為了抓膘復(fù)壯，為采精打下良好的身體基礎(chǔ)，因此，要給足草料，防止種公牛掉膘，但同時(shí)也要注意避免飼喂過(guò)肥，否則會(huì)影響性欲和精液質(zhì)量，精料飼喂量為2～3kg/d；采精期需要營(yíng)養(yǎng)充足，要提高日糧的營(yíng)養(yǎng)水平，尤其蛋白質(zhì)水平，避免種公牛在采精期掉膘，并生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的精液，精料的飼喂量為4～5kg/d。

2.2 管理

種公牛要有專人進(jìn)行飼養(yǎng)管理，不可以隨意更換。要求管理人員膽大心細(xì)，溫柔對(duì)待公牛，嚴(yán)禁抽打。定期（3個(gè)月左右）對(duì)種公牛進(jìn)行稱重，使種公牛保持中等膘情，根據(jù)稱重結(jié)果及時(shí)調(diào)整飼喂方法或飼料配方，防止牛只過(guò)肥。要加強(qiáng)對(duì)種公牛外生殖器官的護(hù)理，定期按摩。

種公牛要保證有充足的運(yùn)動(dòng)量，適當(dāng)運(yùn)動(dòng)可保持種公牛強(qiáng)健的體質(zhì)，使牛身體健康、行動(dòng)靈活、易于配種，性情溫順，還可保持較為旺盛的性欲，提高精液質(zhì)量。舍飼種公牛每天保證有2h的運(yùn)動(dòng)量；每天刷拭牛只被毛1～2次，重點(diǎn)刷頭部和頸部，這樣能保持體表衛(wèi)生、減少體外寄生蟲病、促進(jìn)血液循環(huán)作用。控制好種公牛的采精頻率，一般在18月齡時(shí)開始采精，剛開始時(shí)每隔10～15d采精1次，以后可增加至每隔3～4d采精1次，采精頻率還要根據(jù)季節(jié)的變化合理安排，夏季可每周采精1次，并在早上或者傍晚較為涼爽時(shí)進(jìn)行，冬春季節(jié)可每周2次。種公牛在3～4歲時(shí)精液質(zhì)量最佳，要把握好這個(gè)時(shí)機(jī)，5歲以后繁殖機(jī)能開始下降。

溫度對(duì)精液的品質(zhì)影響較大，尤其是高溫，如果溫度超過(guò)31℃會(huì)使種公牛產(chǎn)生熱應(yīng)激，導(dǎo)致種公牛的食欲減退，采食量下降，體況不佳。牛體溫度升高后會(huì)引起陰囊和睪丸的溫度升高，影響精子生成，還會(huì)導(dǎo)致精子的各項(xiàng)指標(biāo)不達(dá)標(biāo)，因此，要加強(qiáng)種公牛夏季的防暑降溫工作，可以在牛舍和運(yùn)動(dòng)場(chǎng)周圍搭設(shè)涼棚或種植樹木。注意牛舍的通風(fēng)，給牛飲用清涼的井水，并適當(dāng)喂鹽水。采精時(shí)要盡量避開高溫時(shí)段，并減少采精次數(shù)。

⑤手術(shù)目標(biāo)：為了降低術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率，在手術(shù)治療過(guò)程中，應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則。術(shù)后應(yīng)加強(qiáng)呼吸護(hù)理、胸管護(hù)理[2]。由于肺部手術(shù)患者創(chuàng)傷性較大，術(shù)后保持呼吸通暢較為困難，因此患者術(shù)后需持續(xù)吸氧，并定時(shí)對(duì)患者進(jìn)行拍背咳痰，在拍背時(shí)需注意控制力度，當(dāng)痰液過(guò)于粘稠時(shí)，需進(jìn)行霧化吸入，口服化痰藥物。保證患者有效排痰、呼吸通暢，預(yù)防呼吸衰竭或肺部感染。

合理防疫，做好疫苗接種工作，減少免疫使種公牛產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，否則會(huì)導(dǎo)致精液品質(zhì)下降。在注射疫苗期間要加強(qiáng)日糧中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度，以減少應(yīng)激，在生產(chǎn)中應(yīng)合理安排疫苗注射時(shí)間，并盡量減少免疫次數(shù)，避開精液生產(chǎn)的高峰期，以減少接種疫苗對(duì)精液的毒性作用。

2.3 采精訓(xùn)練

種公牛的采精訓(xùn)練對(duì)生產(chǎn)高質(zhì)量的精液及種公牛的使用年限非常關(guān)鍵。

對(duì)種公牛訓(xùn)練過(guò)早、過(guò)晚都不利于優(yōu)質(zhì)種公牛繁殖性能的發(fā)揮。訓(xùn)練過(guò)早，種公牛未達(dá)體成熟，不僅會(huì)抑制公牛正常發(fā)育及健康水平，生產(chǎn)的精液品質(zhì)也較差。訓(xùn)練過(guò)晚，不但訓(xùn)練困難，而且優(yōu)質(zhì)種公牛利用年限縮短，效益降低，因此，為了充分發(fā)揮和牛公牛的種用價(jià)值，對(duì)其訓(xùn)練的最佳時(shí)期是18月齡以前。

訓(xùn)練時(shí)間最好選擇清晨，訓(xùn)練之初，采用觀摩其他公牛采精的方式來(lái)訓(xùn)練，在訓(xùn)練采精前，將發(fā)情母牛的分泌物涂于臺(tái)牛尾部，以此刺激公牛性興奮，要杜絕采用打罵等暴力行為對(duì)待公牛，以免抑制其性活動(dòng)，無(wú)法正常調(diào)動(dòng)公牛性興奮。

3 冷凍精液科學(xué)的生產(chǎn)程序

3.1 前處理

3.1.1 種公牛和臺(tái)牛的處理

種公牛在采精前要進(jìn)行清潔消毒處理，防止精液受細(xì)菌等污染，影響精液質(zhì)量。采精前用清水擦洗公牛下腹部，并用0.1%高錳酸鉀溶液洗凈包皮并擦干；臺(tái)牛應(yīng)選擇大小適中，性情溫和的健康母牛，洗凈并消毒臺(tái)牛后軀部、肛門、會(huì)陰、尾根等部位，將臺(tái)牛固定在采精架內(nèi)，拴好尾部。

3.1.2 器材的準(zhǔn)備

采精所用的器材、設(shè)備等必須經(jīng)過(guò)清洗和消毒處理。采精筒等塑料、橡膠用品每次用完后拆卸下來(lái)，先用洗潔精水清洗，然后用流動(dòng)水沖洗干凈，再用蒸餾水清洗，晾干后用75%酒精擦拭消毒，蒸發(fā)干后放于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，用紫外線消毒30min后備用。集精杯、試管、容量瓶、燒杯、試管、量筒、玻璃棒等玻璃器材先用洗潔精水浸泡后刷洗，然后用流動(dòng)水沖洗，再用蒸餾水清洗后，晾干，用錫箔紙封口，放入干燥箱內(nèi)，用干熱消毒法，維持180℃，1h。紗布、工作服等物品采用高壓蒸汽消毒，壓力121磅，維持30min。配制的稀釋液經(jīng)0.22μm過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾消毒。

3.1.3 稀釋液的配制

基礎(chǔ)液Ⅰ液：蒸餾水100ml，檸檬酸鈉2.97g，卵黃10ml；

基礎(chǔ)液Ⅱ液：取第一液41.75ml，加入果糖2.5g，甘油7ml。

上述稀釋液，每100ml加入青霉素、鏈霉素各5萬(wàn)～10萬(wàn)IU。

3.2 精液的采集

利用假陰道法，采用兩次間隔爬跨法采集精液。采精時(shí)將公牛引至臺(tái)牛后面，采精員站在臺(tái)牛后部右側(cè)，右手握持備好的假陰道。當(dāng)公牛準(zhǔn)備起步爬跨時(shí)，采精人員用左手取下蓋假陰道入口的滅菌紗布；公牛爬跨后迅速用左手準(zhǔn)確托握公牛包皮，將陰莖導(dǎo)入假陰道入口，使假陰道靠在臺(tái)牛臀側(cè)，隨后公牛的后軀向前一沖即完成射精。當(dāng)公?；聲r(shí)，采精人員持假陰道隨公?；?，迅速而自然地取下假陰道，將假陰道直立并重新蓋上滅菌紗布。打開開關(guān)，放出空氣和部分熱水，以便精液完全流入集精杯內(nèi)。然后取下集精杯，蓋上集精杯蓋，貼上標(biāo)簽后送入精液檢查處理室。

3.3 精液的檢測(cè)及稀釋

從遞精液窗口內(nèi)將精液放入精液處理室。將精液倒入事先準(zhǔn)備好的試管中，用膠頭滴管在中間部位取出一滴放入載玻片上，蓋上蓋玻片在顯微鏡下鏡檢。利用密度儀和電子天平稱量重量，輸入精子活力值后，儀器會(huì)自動(dòng)輸出稀釋倍數(shù)，根據(jù)數(shù)值進(jìn)行稀釋。一般鮮精活力在0.7以上，8億/ml為合格新鮮精液。裝有稀釋液的瓶子放入盛有溫水（35℃）的塑料杯中，防止溫度變化過(guò)快，對(duì)精子打擊后活力降低。

3.4 精液的分裝

稀釋后精液進(jìn)行灌裝、打印。將稀釋后的精液輕輕搖勻后緩慢倒入塑料瓶中，灌裝過(guò)程要檢查打印是否清晰，封口是否完整，裝管量是否合適，過(guò)少或過(guò)滿都要挑選出來(lái)以廢棄，分裝過(guò)程要快，防止溫度變化過(guò)快對(duì)精子的影響。

3.5 精液的平衡

分裝好的細(xì)管精液放入4℃的冷柜中平衡4h。平衡可以使稀釋液中的抗凍劑-甘油通過(guò)精子細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)外達(dá)到離子平衡，使精子耐受低溫冷凍。

3.6 精液的冷凍及保存

應(yīng)用自動(dòng)冷凍儀進(jìn)行冷凍處理。將控制溫度先輸入電腦內(nèi)，然后按照輸入程序進(jìn)行冷凍。-15～-50℃是精子受危害最大的溫度區(qū)域，容易形成冰晶，對(duì)精子造成死亡。

當(dāng)細(xì)管冷凍溫度達(dá)到-140℃以后打開冷凍儀，取出細(xì)管凍精，用分裝儀在液氮中將細(xì)管精液分裝于25支小桶內(nèi)，投入液氮灌中保存待檢。

4 冷凍精液質(zhì)量檢測(cè)

4.1 活力檢測(cè)

取兩支和牛細(xì)管冷凍精液，37℃水浴中解凍，用吸水紙擦干細(xì)管上的水分，剪去封口端，把精液推入試管內(nèi)并混勻，用移液器先后吸取混勻后精液10μl，兩次分別放入兩個(gè)載玻片上，蓋上蓋玻片后，在顯微鏡下觀察活力，取兩次活力平均值為待檢批次精液活力值，凍解后活力值在0.35以上則為合格冷凍精液。

4.2 畸形率檢測(cè)

取一支細(xì)管冷凍精液，37℃水浴中解凍，用吸水紙擦干細(xì)管上的水分，剪去封口端，把精液推入試管內(nèi)并混勻，用移液器吸取混勻后精液10μl滴于潔凈載玻片一端，用另一邊緣光滑的凹玻片與載有精液樣品的載玻片呈35℃夾角向前推，將樣品均勻地涂于載玻片上，自然風(fēng)干，同樣制作兩個(gè)抹片。在風(fēng)干的抹片上滴1.0～2.0ml中性福爾馬林固定液，固定15min后用清水緩慢沖掉固定液，然后自然風(fēng)干。再將風(fēng)干的抹片反扣在帶染色板上，把姬姆薩液滴于槽和抹片之間，讓其充滿平槽并使抹片接觸染液，1.5h后用清水緩慢沖去染液，晾干后放在顯微鏡下觀察，每個(gè)抹片觀察300個(gè)精子，觀察時(shí)選取載玻片的中間部位，取兩抹片觀察的平均值，精子畸形率低于20%的精液為合格精液。

4.3 細(xì)菌數(shù)檢測(cè)

取兩支細(xì)管冷凍精液，37℃水浴中解凍，用吸水紙擦干細(xì)管上的水分。在超凈工作臺(tái)內(nèi)點(diǎn)燃酒精燈，平皿蓋上做好標(biāo)記，用酒精棉球消毒整支細(xì)管，酒精燈下灼燒法消毒細(xì)管剪后，待剪降溫后，剪去超聲波封口端，將整支細(xì)管精液注入滅菌平皿內(nèi)。及時(shí)將53℃水浴內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約10～15ml，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿混合均勻。同時(shí)，將營(yíng)養(yǎng)基瓊脂培養(yǎng)基傾入滅菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h后立即計(jì)數(shù)。做平板菌落計(jì)數(shù)時(shí)，應(yīng)在光線較強(qiáng)處，用肉眼觀察，輔助放大鏡觀察，避免遺漏，可用菌落計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。取兩個(gè)平板菌落的平均數(shù)減去空白樣板菌落數(shù)為待檢精液每支細(xì)管菌落數(shù)，每支細(xì)管（0.25ml）精液培養(yǎng)菌落數(shù)大于1000個(gè)為不合格。

檢驗(yàn)合格的冷凍細(xì)管精液才可用于生產(chǎn)。