鈣蛋白酶抑制蛋白基因作為肉質(zhì)候選基因的研究進(jìn)展

陳冬金 陳巖鋒 桑雷 孫世坤 王錦祥 謝喜平

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所350013）

隨著生活水平的提高，人們對畜禽肌肉品質(zhì)要求越來越高，而影響畜禽肌肉品質(zhì)的因素有很多，其中嫩度是一個很重要的評價指標(biāo)。目前CAST基因被列入與畜禽肌肉嫩度有關(guān)的重要候選基因之一。

鈣蛋白酶抑制蛋白（Calpastatin，CAST）是鈣激活蛋白酶系統(tǒng)的內(nèi)源性抑制蛋白，參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)、神經(jīng)發(fā)育、機體肌肉生長等，其活性需要鈣離子的激活。它可以通過識別被Ca2+激活后的鈣蛋白酶的構(gòu)象變化，并與之特異性結(jié)合，達(dá)到抑制蛋白酶活性的功效。通過調(diào)節(jié)鈣蛋白酶和鈣蛋白酶抑制蛋白的活性，影響畜禽肌肉的生長發(fā)育，也可參與肌肉生長中蛋白質(zhì)的更新和抑制肌肉內(nèi)蛋白質(zhì)的降解[1]，提高肌肉嫩度，改善肉質(zhì)。鈣蛋白酶抑制蛋白通過確保鈣蛋白酶對底物特定位點的水解抑制鈣蛋白酶活性。

1 鈣蛋白酶抑制蛋白結(jié)構(gòu)特征

鈣蛋白酶抑制蛋白于1964年被正式認(rèn)定為鈣蛋白酶系統(tǒng)的成員[2]，1979年被正式命名為鈣蛋白酶抑制酶，1987年鈣蛋白酶抑制蛋白首先被克隆出cDNA[3]。隨后科學(xué)家成功地克隆與測序出多種不同的哺乳動物不同組織中CAST的cDNA[4]。比較不同物種的CASTcDNA序列發(fā)現(xiàn)其保守性較差，其蛋白由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ5個結(jié)構(gòu)域組成。第一個結(jié)構(gòu)域Ⅰ（L結(jié)構(gòu)域）功能研究還沒有明確，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ結(jié)構(gòu)域每個結(jié)構(gòu)域都是由140個氨基酸殘基組成，且相互之間具有20%～35%的氨基酸殘基同源性，且這4個結(jié)構(gòu)域均是由4個相似重復(fù)單位，并組成了CAST蛋白的活性中心[2]。每個重復(fù)單位含有A、B、C3個保守區(qū)，而發(fā)揮CAST抑制作用的關(guān)鍵部位可能是B區(qū)十分保守的七肽序列（Thr-Ile-Pro-Pro-X-Tyr-Arg）。CAST根據(jù)分子大小不同，功能性質(zhì)相似的特點，可以分為主要存在于紅細(xì)胞的70KD和主要存在于肝、心臟和其他組織中110KD兩種類型。

2 基因定位及表達(dá)

CAST基因的定位和編碼序列長度物種間存在差異。人的CAST基因定位于染色體5ql4-q22區(qū)段；牛的CAST基因定位于7號染色體上，其cDNA序列包含31個內(nèi)含子和30個外顯子；雞和豬CAST基因都定位于2號染色體上，雞的CAST的mRNA由30個內(nèi)含子和31個外顯子組成，全長為3551bp，而豬的CAST基因還發(fā)現(xiàn)品種間基因位點存在Rsal-RFLP和MspI，推測CAST基因是肌蛋白積累和肉質(zhì)的一個候選基因。CAST基因表達(dá)的模式不同，如牛的該基因有4個啟動子共同指導(dǎo)表達(dá)，且外顯子可能遺漏、轉(zhuǎn)錄、翻譯、翻譯后水平等不同水平的調(diào)控，這對CAST基因發(fā)揮其抑制鈣蛋白酶水解和與肉品質(zhì)形成的作用中具有一定的生理學(xué)意義。

3 鈣蛋白酶抑制蛋白的調(diào)節(jié)機理

鈣蛋白酶抑制蛋白是一種需Ca2+激活的、內(nèi)源性的鈣蛋白酶抑制蛋白劑，可使肌肉內(nèi)蛋白質(zhì)降解受到抑制，肌細(xì)胞生長速度得以降低。該蛋白可在畜禽屠宰后對鈣蛋白酶的活性起抑制作用，從而降低肌肉蛋白質(zhì)的水解。鈣蛋白酶與鈣蛋白酶抑制蛋白的結(jié)合是可逆的，即有Ca2+時結(jié)合無Ca2+時分離。其抑制過程：首先是該蛋白的第2～5結(jié)構(gòu)域中的A和C保守區(qū)，與鈣蛋白酶的第4結(jié)構(gòu)域與第6結(jié)構(gòu)域緊密結(jié)合，然后B保守區(qū)與鈣蛋酶的第2結(jié)構(gòu)域結(jié)合而發(fā)揮抑制作用。根據(jù)該過程推測可以通過降低鈣蛋白酶抑制蛋白的活性或激活鈣蛋白酶來提高肌肉的嫩度來改善肉品質(zhì)。

畜禽屠宰后，機體肌肉組織細(xì)胞中的肌漿網(wǎng)和線粒體外泄Ca2+增多，保留的Ca2+較少，Ca2+濃度的增加 （最終達(dá)到0.2mmol/L）使得肌原纖維中細(xì)絲的構(gòu)象發(fā)現(xiàn)改變，促進(jìn)細(xì)絲中肌動蛋白與肌原纖維粗絲中肌球蛋白的結(jié)合，從而導(dǎo)致屠宰后肌肉的收縮和僵硬。同時Ca2+濃度的增加也使鈣蛋白酶的活性增強，促使肌節(jié)變短。屠宰后當(dāng)溶酶體裂解后，組織蛋白酶被釋放出來，并與鈣蛋白酶作用一起使肌肉進(jìn)一步嫩化繼續(xù)。CAST的水平與畜禽屠宰后蛋白質(zhì)水解的程度和速度相關(guān)，同時鈣激活酶引起的鈣激活酶抑制蛋白降解在調(diào)節(jié)影響肉質(zhì)嫩化程度的蛋白質(zhì)水解方面起著重要的作用。

4 CAST基因與肌肉生長及嫩度相關(guān)研究進(jìn)展

4.1 牛CAST基因國外國內(nèi)研究情況

Barendse（2002）[5]最早在對牛CAST基因3′非翻譯區(qū)研究中，發(fā)現(xiàn)在2959處存在一個SNP位點（CAST-T1）。Morris（2006）[6]等用DdeI-PCR-RFLP分析該位點，且表明該位點對牛肉剪切力有顯著影響。Casas（2006）等[7]分析該位點與肉品質(zhì)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)該位點的TT基因型與牛肉嫩度極顯著相關(guān)（＜0.003），該位點與牛肉多汁性也顯著相關(guān)。Schenkel（2006）等[8]研究發(fā)現(xiàn)，牛CAST基因第5內(nèi)含子257bp處檢測到一個SNP位點，且發(fā)現(xiàn)該位點CC基因型與牛肉剪切力有極顯著相關(guān)。Eenennaam（2007）等[9]也發(fā)現(xiàn)該位點與牛肉剪切力、嫩度顯著相關(guān)。Smith(2009)等[10]研究表明，該SNP位點與背最長CAST活性極顯著相關(guān)（＜0.01），與牛肉剪切力顯著相關(guān)（P＜0.05）。Reardon（2010）等[11]研究發(fā)現(xiàn)，該SNP位點與Irish雜交牛的pH和肉色有顯著性相關(guān)。鄧桂馨（2003）等[12]對牛CAST基因第6內(nèi)含子研究發(fā)現(xiàn)，存在C/G突變，B等位優(yōu)勢基因，且BB基因型對牛肉嫩度有顯著性的影響。H.Y.CHUNG(2000)[13]等研究發(fā)現(xiàn)，CAST基因型與CAST活性的相關(guān)性，以及在心臟、腎脂肪的分布都呈顯著性差異。

4.2 豬CAST基因國外國內(nèi)研究情況

Ciobanu等[14]（2004）研究表明，豬CAST基因與豬肉的蒸煮損失、系水力、多汁性均有顯著性相關(guān)，但對pH的影響較小。Krzercio等[15]（2008）研究豬CAST基因第6內(nèi)含子發(fā)現(xiàn)SNP位點，且該位點與各成熟期的豬肉蛋白含量及pH呈顯著相關(guān)。K.Ropka-Molika等[16]（2014）分析CAST基因多態(tài)位點與肉品種相關(guān)，其中CAST/Rsal和CAST/Hpall對系水力影響最大，其次是肌內(nèi)脂肪含量。孫立彬（2004）[17]分析了豬CAST基因型與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，CAST基因?qū)χ竞坑酗@著影響，同時還證明了CAST基因是可以作為肉質(zhì)相關(guān)性狀的候選基因。程豐等（2006）[18]研究發(fā)現(xiàn)，CAST基因?qū)π聵s昌Ⅰ系豬肉失水率有顯著性的影響，CAST基因型與豬肉的嫩度存在相關(guān)性，CAST基因存在RasⅠ、MspⅠ、HinfⅠ等內(nèi)切酶的酶切位點，為該基因作為豬肉嫩度的候選基因奠定基礎(chǔ)。薛慧良（2008）等[19]共檢測到豬CAST基因第24內(nèi)含子A916G和C1633G兩個SNP位點，將不同基因型個體進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在屠宰45min后的pH有顯著性差異。

4.3 其他動物CAST基因

燕鳳等（2008）[20]研究綿羊CAST基因其表達(dá)量與背最長肌失水率有顯著性負(fù)相關(guān)。Harper[21]等研究發(fā)現(xiàn)，鈣蛋白酶抑制劑在胸肌中的含量增多會導(dǎo)致選育的生長種雞比蛋雞降解肌肉蛋白的速度慢，同時還發(fā)現(xiàn)肉雞胸肌中的CAST表達(dá)量比本地雞大，由于鈣蛋白酶被激活后會引起蛋白降解，而CAST能抑制其活性，因此，CAST基因可作為影響肌肉生長的候選基因。除了上述多態(tài)位點，學(xué)者們還發(fā)現(xiàn)了其他與肉品質(zhì)高度相關(guān)的變異位點。大量研究證實，CAST基因是研究肉質(zhì)性狀的候選基因，研究其突變會對研究肉品質(zhì)有很大的作用。

5 小結(jié)

肉質(zhì)性狀主要指肉的風(fēng)味、多汁性、嫩度和色澤等，其中嫩度影響肌肉品質(zhì)的主要指標(biāo)之一。影響畜禽肌肉嫩度的首要因素是肌肉中肌原纖維蛋白的降解程度，且CAST基因作為與嫩度相關(guān)性較大的肉質(zhì)候選基因，所以可以通過基因技術(shù)調(diào)控CAST基因在肌肉組織中的表達(dá)量，調(diào)節(jié)肌原纖維蛋白質(zhì)的降解，從分子水平上對肌肉生長和肌肉嫩度進(jìn)行調(diào)控，從而達(dá)到提高畜禽肌肉生長和改善肉質(zhì)的目的，這對提高畜禽的肉品質(zhì)具有重要的意義。但具體的調(diào)控機理目前還不清晰，有待于進(jìn)一步深入研究。