鯉皰疹病毒（CyHV-3）及抗病選育研究現(xiàn)狀與進展

孫佳鑫，石連玉，賈智英

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

鯉皰疹病毒（CyHV-3）病是由錦鯉皰疹病毒（Koi Herpesvirus,KHV）引起的鯉Cyprinus carpio和錦鯉傳染并致死性病毒病。錦鯉皰疹病毒又稱鯉皰疹病毒Ⅲ型（Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3），也有文獻稱為鯉間質(zhì)性腎炎及鰓壞死病毒（Carp interstitial nephritis and gill necrosis virus,CNGV）。KHV主要感染錦鯉和普通鯉及其變種，死亡率高達75%～95%[1]，是威脅鯉和錦鯉養(yǎng)殖業(yè)安全的一種病毒性疾病，引起了世界動物衛(wèi)生組織（OIE）的高度重視，于2006 年將錦鯉皰疹病毒?。↘HVD）列為必須報告的疾病[2]。2001 年該疾病在香港首次爆發(fā)，被中國農(nóng)業(yè)部列在《一、二、三類動物疫病病種名錄》中的二類疫病[3]。

1 病原學(xué)

鯉皰疹病毒Ⅲ型（CyHV-3）與CyHV-1 和Cy-HV-2 同屬于皰疹病毒目中的皰疹病毒科[4]。2009年國際病毒分類委員會（International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV）將該病毒列入皰疹病毒目Herpesvirales、異皰疹病毒科Alloherpesviridae、鯉皰疹病毒屬Cyprini-virus[5]。鯉皰疹病毒是雙鏈DNA病毒，基因組全長295kb，包含兩端22 個正向重讀序列，G 堿基和C 堿基含量比例為59.2%?；蚪M共編碼164 個開放閱讀框（ORF），包含其中8 個末端重復(fù)ORF，是基因組最大的皰疹病毒[6]。

2 流行病學(xué)特征

2.1 研究歷史和地理分布

1996 年，英國的野生鯉中曾發(fā)現(xiàn)過鯉皰疹病毒，但沒有公開報道。1997 年德國首次正式報道[7]。1998 年美國科學(xué)家在以色列爆發(fā)的錦鯉病魚中分離鑒定出了該病的病原為鯉皰疹病毒（Koi Herpesvirus Diease,KHVD）。2001 年，鯉皰疹病毒在香港首次爆發(fā)，次年入侵中國臺灣以及廣東地區(qū)，但是，當(dāng)時并沒有引起重視，造成了大批量鯉、錦鯉死亡，死亡率高達80%～100%[8,9]。2002 年，該病毒在印度尼西亞暴發(fā)，損失高達上百萬美元。2003 年，僅一個月內(nèi)，日本鯉和錦鯉的死亡量就達1 125t[9]。

目前，鯉皰疹病毒已經(jīng)蔓延到鯉主養(yǎng)區(qū)，據(jù)不完全統(tǒng)計，已有30 多個國家報道過鯉皰疹病毒病。錦鯉和鯉的觀賞價值及經(jīng)濟價值極高，鯉間國際貿(mào)易和交流是該病毒快速傳播的主要原因，而該病的爆發(fā)不僅對魚類養(yǎng)殖業(yè)造成了不小的沖擊，也對中國水生動物進出口貿(mào)易帶來較大經(jīng)濟損失和政治影響。

2.2 病毒宿主

鯉皰疹病毒具有高度傳染性和極強的毒性，其宿主可為錦鯉、鯉及其普通變種，但感染卻僅限于鯉、錦鯉[8]。鱗片是魚體的第一道屏障，鱗片極少的鏡鯉比全鱗的鯉更易感染病毒[7]。而與鯉種系相近的金魚Carassius auratus 和異育銀鯽Carassius auratus gibelio，則有可能成為潛在的病毒攜帶者[10]。對病毒生活環(huán)境的研究表明：水體的沉積物和水生脊椎動物也是持續(xù)攜帶鯉皰疹病毒的宿主之一[7]。各階段的魚體，像魚苗、幼魚、成魚都可能感染鯉皰疹病毒，關(guān)于易染病階段，目前有兩種截然相反的說法。一種認(rèn)為：幼魚比成魚更易感染病毒，因為幼魚的免疫系統(tǒng)不健全，對病毒的抵抗力和免疫力比較低[7]。而另一種說法是：群集、繁殖可能會加劇病毒的傳播，所以性成熟期的魚比魚苗更易感染[11]。但是，Mccoll 等[12]發(fā)現(xiàn)，感染該病毒后，體長小于2.0cm 的幼魚不死亡。

2.3 病毒生長環(huán)境

鯉皰疹病毒在水體中生存、繁殖和傳播，而魚類的分泌物為病毒提供了營養(yǎng)和更適宜生長的環(huán)境，所以病毒在魚體上可存活4h 左右。當(dāng)溫度限制病毒存活時，鯉皰疹病毒在魚體內(nèi)以一種潛伏狀態(tài)持續(xù)存活。當(dāng)魚體轉(zhuǎn)入適合溫度時，病毒再次恢復(fù)活力[13]。雖然鯉皰疹病毒的適應(yīng)能力很強，但是對酸堿性的抗性較弱，當(dāng)pH＜3 和＞11 時，鯉皰疹病毒不能生存[14]。

鯉皰疹病毒最適合的生存水溫在18～30℃之間，與魚類的生存環(huán)境非常接近，魚類很容易感染，很難通過調(diào)節(jié)水溫來控制病毒的生存和傳播。當(dāng)病毒處于適宜溫度時，魚群會大規(guī)模發(fā)病、死亡，幸存的魚成為疾病的傳播者；當(dāng)溫度不適宜時，魚類會感染病毒，但不發(fā)病。

2.4 傳播方式和流行季節(jié)

鯉皰疹病毒主要通過魚類的糞便、尿液、鰓和皮膚粘液進行傳播，當(dāng)病毒擴散時，魚會被水里、土壤里的病毒感染，接觸病魚也會被感染[15]。鯉皰疹病毒病發(fā)病的最適溫度為23～25℃，潛伏期約14d。發(fā)病主要集中在春末夏初和初秋兩季傳染，水溫在30℃以上或者10℃以下都不適宜病毒生存，病毒進入休眠狀態(tài)，不復(fù)制或病毒量很低[10]，即使有魚患病，依靠自身的免疫力也可自行治愈。

Miwa 等[16]研究了鯉皰疹病毒Ⅲ的發(fā)病機制，發(fā)現(xiàn)在第5～8d 取樣的魚中，皮膚表皮受損最嚴(yán)重，引起的滲透性休克是急性死亡的直接原因。而感染病毒一年后，鯉中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了大量的病毒，病毒可持續(xù)感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)，形成潛伏期。

2.5 發(fā)病癥狀

鯉皰疹病毒使鯉發(fā)生間質(zhì)性腎炎、鰓壞死[17]。檢測病魚腦、眼、鰓、脾、腎、肝和腸內(nèi)容物等時發(fā)現(xiàn)了鯉皰疹病毒。不同感染期病魚的癥狀不同[18]。感染初期，魚體游動緩慢、打轉(zhuǎn)，體表出現(xiàn)白斑，少量出血；魚眼凹陷，眼底出血，類似寄生蟲感染和細菌感染；鱗片松動隨后脫落并帶有紅血絲；皮下組織和肌肉出血；肛門紅腫；鰭條充血，尾鰭最嚴(yán)重，臀鰭和背鰭次之；鰓絲深紅色，剪去全鰓，流血量減少且迅速凝固；腸道充血發(fā)紅且硬挺，腎腫大發(fā)紅，脾臟有出血點，膽汁顏色較深[19]。

感染中后期，病魚萎靡、行為反常、食欲下降；漂浮在水面，不能主動游泳；撕開皮膚可看見明顯的紅血絲，伴有蒼白塊斑與水泡，體表局部潰瘍，分泌大量黏液[20]，患病魚在1～2d 后開始死亡，2～4d 后死亡率可達80%～100%。發(fā)病時具有發(fā)病急、感染率高和死亡率高等特點。鯉皰疹病毒可通過皮膚和牙周咽粘膜感染進入魚體[21]。但是，有研究發(fā)現(xiàn)，清除皮膚粘液或者表皮損傷后，加劇病毒侵入魚體，這說明皮膚粘液具有先天免疫功能，可阻止病毒從表皮進入[22]。

3 檢測方法

3.1 分子生物學(xué)檢測技術(shù)

3.1.1 熒光定量PCR 檢測

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）操作方便、迅速、檢測靈敏度高，可精準(zhǔn)檢測鯉皰疹病毒病感染，是檢測病毒最常用的方法之一。在定性PCR 技術(shù)中加入熒光集團，發(fā)展出了熒光定量PCR 技術(shù)，通過實時檢測產(chǎn)物中的熒光信號強度來定量。熒光定量PCR 具有靈敏性高、特異性高和精確性高的優(yōu)點。PCR 檢測技術(shù)可檢驗出病魚體內(nèi)鯉皰疹病毒呈陽性，但是對潛伏感染的魚類病毒攜帶者，即外表健康的魚，則無法輕易檢測出是否感染了病毒[23]。

數(shù)字PCR 精確、靈敏，實現(xiàn)了單分子DNA 的絕對定量，是DNA 定量檢測的新技術(shù)。Mie 等[24]利用數(shù)字PCR 技術(shù)從湖泊和池塘沉積物中提取Cy-HV-3，定量比較了沉積物和水體中CyHV-3 的豐度，說明沉積物可成為自然淡水環(huán)境中CyHV-3 的儲集層。

3.1.2 LAMP 檢測

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）是一種新式恒溫核酸擴增方法，更簡便快速、準(zhǔn)確、廉價、易檢測，可目視直接讀取。LAMP 經(jīng)一系列改良后，逐漸將免疫捕獲與直接綁定技術(shù)和核算測流分析技術(shù)應(yīng)用于LAMP方法中，使LAMP 方法的敏感度和特異性越來越高，降低了交叉污染的風(fēng)險[25]，可能成為快速檢測鯉皰疹病毒的有力工具。LAMP 檢測法因為不需要熱循環(huán)儀，適合在發(fā)病現(xiàn)場檢測，目前已經(jīng)研發(fā)出相關(guān)試紙條，雖然成本較高，但LAMP 方法具有良好的應(yīng)用前景。

3.2 免疫學(xué)檢測技術(shù)

免疫學(xué)檢測（ELISA）是一種間接診斷方法，也是常見的病原或抗體檢測方法。這種檢測方法依賴抗原抗體特異性結(jié)合，通過免疫組織化學(xué)和免疫熒光測定方法，分別在感染魚的組織器官和觸摸印跡中，檢測錦鯉和鯉血清中的特異性抗體[29]。因為不易檢測出魚類血清中的低水平抗體，所以ELISA 的應(yīng)用受到了一定的限制[18]。

3.3 電鏡觀察

電子顯微鏡技術(shù)是研究病毒形態(tài)學(xué)不可或缺的工具，在病原確診過程中常作為重要的輔助手段，能觀察患病組織中病毒的形態(tài)和大小。在首次進行鯉皰疹病毒分離時，應(yīng)用的就是電鏡技術(shù)進行輔助診斷，在鰓上細胞中觀察到了鯉皰疹病毒的核衣殼[26]。用電鏡技術(shù)研究鯉皰疹病毒的超微結(jié)構(gòu)[27]，詳細描述其形態(tài)學(xué)[28]的研究很多。

3.4 其他方法

除了以上方法以外，還有原位雜交技術(shù)、免疫印跡熒光分析、基因芯片多重檢測等。原位雜交技術(shù)是從細胞水平對病毒進行檢測，其敏感度和準(zhǔn)確度高，應(yīng)用廣泛，但是，設(shè)備儀器非常昂貴，不適宜推廣應(yīng)用。多樣的檢測方法可以增加疾病防控的新思路，為未來的疾病防控提供了更多的可能性。

4 抗病性狀選育

4.1 抗病性狀遺傳基礎(chǔ)

開展鯉抗病遺傳改良工作的基礎(chǔ)是找到群體或個體間的抗病變異，提高育種對象對某種疾病易感性的遺傳變異是育種工作的基礎(chǔ)。degrd 等[30]研究了4 個鯉群體（Szarvas 群體、Armur 群體、Duna 群體和Tana 群體）對皰疹病毒的抗性，發(fā)現(xiàn)這4 個群體感染皰疹病毒后，存活率差異顯著，分別為0%、11%、12%和21%。利用這4 個群體建立了92 個家系，計算了相關(guān)抗病遺傳力，其中對皰疹病毒的抗病力高達0.79。養(yǎng)殖鯉遺傳變異低于野生鯉，鯉養(yǎng)殖品系與野生群體間也存在明顯的遺傳抗病差異[31]。影響鯉抗病力的主要因素是遺傳，不同群體或品系的鯉抗病性能存在明顯的遺傳差異[32]。黑龍江水產(chǎn)研究所分析了我國北方網(wǎng)箱養(yǎng)殖中爆發(fā)性死亡的德國鏡鯉的死亡個體和存活個體分子樣品的遺傳結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)死亡和存活的德國鏡鯉個體的遺傳性不同，而這種差異可能導(dǎo)致二者抗病性能的不同[33]。

4.2 鯉皰疹病毒抗病機制

Neave 等[34]對鯉前腎進行了轉(zhuǎn)錄組分析，研究了免疫球蛋白和同系物的功能差異，對感染鯉皰疹病毒的鯉進行轉(zhuǎn)錄組測序，檢測兩種宿主的基因表達得到的結(jié)論是：在鯉皰疹病毒急性感染過程中，鯉基因組中不同感染階段的許多免疫相關(guān)基因被相繼表達。這表明適應(yīng)性免疫反應(yīng)在抗病過程中起重要作用。Lee 等[35]對感染鯉皰疹病毒Ⅲ（CyHV3）的鯉腦脾組織進行轉(zhuǎn)錄分析，用高通量測序技術(shù)在轉(zhuǎn)錄組水平分析差異表達基因（DEGs）。對DEGs 的KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析顯示，總共有12 002 個DEG unigenes 被注釋到256 個通路，這些通路分為6 大類。實時熒光定量PCR 驗證了20 個差異表達基因。

4.3 抗病相關(guān)標(biāo)記的篩選

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進步和基因組資源的開發(fā)，開發(fā)了大量性狀相關(guān)的標(biāo)記，分子標(biāo)記輔助技術(shù)也得以應(yīng)用，分子輔助育種在抗病性狀選育中起到了舉足輕重的作用。如在牙鲆Paralichthys olivaceus抗淋巴囊腫品種選育過程中，分子標(biāo)記發(fā)揮了重要的輔助作用，將培育的100 多萬尾抗病牙鲆魚種養(yǎng)殖在27 個養(yǎng)殖場，發(fā)病率幾乎為零[36]。在鯉抗皰疹病毒中也進行了抗病相關(guān)標(biāo)記的開發(fā)和相關(guān)輔助育種工作。Rakus 等[37]研究了皰疹病毒的抗性之間的關(guān)系，實驗中，8～12d 時，感染皰疹病毒的魚死亡率高達79.9%。PCR-RF-SSCP 分析發(fā)現(xiàn)：主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）classⅡB 一種基因型與皰疹病毒的抗藥性有關(guān)。Pawapol 等[38]研究了14 個基因的23 個SNP 位點與皰疹病毒抗病的相關(guān)性，認(rèn)為zIL-10a 基因具有GCG 雜合或純合基因型，對皰疹病毒均易感。Jia 等[39]也對MHC 進行了抗病相關(guān)性的研究，在MHC classⅠ和classⅡ中篩選到2 個相關(guān)位點，成功指導(dǎo)了抗皰疹病毒鏡鯉新品種的選育。

4.4 抗皰疹病毒品種選育的研究進展

群體選育和家系選育方法較為成熟，被廣泛運用到魚類的抗病育種中[31]。群體選育一般適合選育性狀可控制的基因數(shù)較少時，而家系選育則用于性狀可控制的基因數(shù)較多，或者遺傳力較低時。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，分子輔助育種技術(shù)在魚類抗病育種中也得到了廣泛應(yīng)用[32]。

中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所采取了群體選育、家系選育和分子輔助育種相結(jié)合的方法，選育抗皰疹病毒的鏡鯉，目前已選育到F3代，F(xiàn)1、F2和F3成活率分別為61.1%、88.6%和92.5%[40]，不同選育世代抗病性能及顯著性分析表明，F(xiàn)2、F3與F1成活率差異顯著，而F2、F3間差異不顯著，說明F3抗病性狀趨于穩(wěn)定。白珊珊等[40]利用熒光定量PCR 技術(shù)比較了F1、F2、F3世代選育免疫基因表達以及鯉皰疹病毒的病毒載量。結(jié)果表明：在F1、F2和F3當(dāng)中，鯉皰疹病毒的病毒載量逐漸下降，說明隨著選育的進行和抗病性能的提高，病毒載量逐漸降低。

5 展望

鯉皰疹病毒作為一種流行性病毒，自20 世紀(jì)90 年代末首次報道以來，已在全世界各地傳播，嚴(yán)重威脅了鯉養(yǎng)殖業(yè)。雖然鯉皰疹病毒已研究很久了，相關(guān)診斷技術(shù)和治療手段仍存在不足，如基因組每個基因功能的確定、診斷方法、敏感細胞系的建立和研制有效疫苗等仍需深入研究。

雖然疾病控制的意識普遍提高，也提供了很多檢測診斷、感染宿主、傳播途徑以及疫苗制備等臨床結(jié)果分析，但是，對該病毒的入侵機理、病毒宿主關(guān)系等還有爭議，仍沒有有效控制鯉皰疹病毒的方法。應(yīng)借鑒對鯉皰疹病毒研究較早國家的防治經(jīng)驗，抑制其大范圍擴散。