高效液相色譜測(cè)定乳制品中黃曲霉毒素M1

□ 朱丹倩 陶志成 孔玉婷 姚菲菲 浙江贊宇科技股份有限公司 浙江金正檢測(cè)有限公司

AFM1是哺乳動(dòng)物攝入被黃曲霉毒素 B1（Af latoxin B1，AFB1）污染的飼料后通過在體內(nèi)經(jīng)羥基化作用轉(zhuǎn)化成的代謝產(chǎn)物。AFM1對(duì)光、熱和酸都非常穩(wěn)定，主要存在于動(dòng)物的可食部分，如牛奶、肝、蛋類等，其中以牛奶最為常見，是目前發(fā)現(xiàn)的毒性、致癌性極強(qiáng)的天然有毒物，它能夠?qū)θ思皠?dòng)物的肝臟組織產(chǎn)生破壞，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致肝癌甚至死亡。由于牛乳及其乳制品是人類（尤其是嬰幼兒）的主要食品，乳制品營(yíng)養(yǎng)豐富，能夠增強(qiáng)人體免疫力，受到很多國(guó)家的重視。因此建立簡(jiǎn)便快捷高效的檢測(cè)方法十分重要。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260超高效液相色譜儀（配熒光檢測(cè)器）（美國(guó)Agilent公司）；3-18KS高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sartorius公司）；純水凈化儀（杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司）；ME3basic振蕩器（IKA公司）。

甲醇、乙腈均為色譜純（美國(guó)大地公司）；吡啶鎓三溴化物（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；免疫親和柱（北京安易世紀(jì)貿(mào)易有限公司）；黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品（o2si smart solutions公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)溶液移取至10 mL容量瓶中，加乙腈稀釋至刻度。此溶液密封后避光4 ℃下保存。按需要用初始比例的流動(dòng)相稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用[1]。

1.2.2 色譜條件

賽默飛 C18（4.6 μm×250 mm）色譜柱；柱溫35 ℃；流速1 mL/min（衍生劑：0.3 mL/min），進(jìn)樣量50 μL；流動(dòng)相為甲醇∶水=54∶46（V∶V）。熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)440 nm。

1.2.3 提取方法

稱取5 g混合均勻的試樣于50 mL離心管中（乳粉、特殊膳食等加入熱水,渦旋混勻）。加入10 mL甲醇，渦旋3 min。置于4 ℃、6 000 r/min下離心10 min，將適量上清液或?yàn)V液轉(zhuǎn)移至燒杯中，加40 mL水備用。將上述樣液移過免疫親和柱。收集全部洗脫液。在50 ℃下氮?dú)饩従彽貙⑾疵撘捍抵? mL以下，用水定容至1.0 mL，渦旋30 s混勻，0.22 μm 濾膜過濾，收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

選取賽默飛C18色譜柱（4.6μm×250 mm），對(duì)乙腈、甲醇、水等流動(dòng)及衍生劑相進(jìn)行組合，考察其保留時(shí)間、靈敏度及峰形，選取最優(yōu)的流動(dòng)相體系。本試驗(yàn)使用甲醇代替乙腈可有效降低檢測(cè)成本。本試驗(yàn)將方法優(yōu)化為流動(dòng)相：甲醇∶水=54∶46（V∶V），流速為1 mL/min，吡啶鎓三溴化物為衍生劑0.3 mL/min，明顯提高了靈敏度，且方便與黃曲霉毒素B族一同檢測(cè)[2]。

2.2 提取條件選擇

本試驗(yàn)采用AFM1免疫親和柱作為樣品前處理方法，該方法能夠從復(fù)雜基質(zhì)中富集極低濃度的目標(biāo)化合物，并具有極高的選擇性。洗脫時(shí)使用2 mL甲醇可以充分將待測(cè)物洗脫，氮吹至1 mL以下直接加水稀釋至1 mL減輕溶劑效應(yīng)，避免損失，操作簡(jiǎn)便，提高了檢測(cè)效率。

2.3 方法線性關(guān)系、精密度和檢出限

黃曲霉毒素M1在0.1～20 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)大于0.999，不同陰性樣品基質(zhì)中在3個(gè)濃度水平加標(biāo)試驗(yàn)回收率在83.6% ～94.2，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.68%，方法檢測(cè)限（LOD，S/N≥3）為0.02 μg/kg。本方法簡(jiǎn)便快速，重現(xiàn)性好，靈敏度高，結(jié)果可靠。

3 討論

本文建立了高效液相色譜測(cè)定乳制品中黃曲霉毒素M1的方法。試樣中的黃曲霉毒素M1用甲醇-水溶液提取，上清液稀釋后，經(jīng)免疫親和柱凈化和富集，凈化液濃縮后經(jīng)液相色譜分離檢測(cè)。與目前的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報(bào)道的方法相比，本方法在保證準(zhǔn)確性好的同時(shí)，盡可能地提高了靈敏度，為測(cè)定食品中黃曲霉毒素M1的研究提供了數(shù)據(jù)和基礎(chǔ)。