云杉屬樹種體胚發(fā)生研究進(jìn)展

李青梅，高 芳，韓 姣，孫 悅，趙吉?jiǎng)? 陳士剛

（1.吉林省林業(yè)科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130033；2.長(zhǎng)白山森工集團(tuán)敦化林業(yè)有限公司，吉林 敦化 133700）

云杉屬樹種具有適應(yīng)性強(qiáng)、抗逆速生等優(yōu)點(diǎn)，是園林綠化與用材的重要樹種。云杉屬樹種傳統(tǒng)的繁殖方法為種子繁殖和扦插繁殖，種子繁殖存在繁殖周期長(zhǎng)，優(yōu)良遺傳基因退化以及遺傳性狀不穩(wěn)定的現(xiàn)象，且云杉屬樹種生長(zhǎng)緩慢，一般要4～5年才能獲得可移栽的苗木。而扦插繁殖存在繁殖系數(shù)與成活率低等問題。在云杉屬樹種的育種工作中，利用體胚發(fā)生技術(shù)與傳統(tǒng)的繁殖技術(shù)相結(jié)合，能夠較好的解決這些問題。

體細(xì)胞胚胎發(fā)生是指雙倍體或單倍體的體細(xì)胞（非合子細(xì)胞）在特定條件下，未經(jīng)性細(xì)胞融合而通過與合子胚胎發(fā)生類似的途徑發(fā)育出新個(gè)體的形態(tài)發(fā)育過程。具有遺傳穩(wěn)定、繁殖快、數(shù)量多、結(jié)構(gòu)完整等優(yōu)點(diǎn)，并且具有以低成本繁育出大量高品質(zhì)苗木的潛能。體胚發(fā)生技術(shù)在云杉屬樹種應(yīng)用較為廣泛，該技術(shù)為云杉屬樹種的品種改良和規(guī)?；敝程峁┹^為理想的技術(shù)平臺(tái)，本文綜述了云杉屬樹種體胚發(fā)生的現(xiàn)狀、影響因素及當(dāng)前存在的問題，以便為云杉屬樹種建立高效的體胚發(fā)生體系提供借鑒。

1 云杉屬樹種體胚發(fā)生的研究現(xiàn)狀

云杉屬樹種全世界約40種，我國(guó)云杉屬樹種資源豐富，有16種9變種。1985年Hakman等首次報(bào)道了挪威云杉體胚發(fā)生并獲得再生植株，使云杉屬樹種體胚發(fā)生體系有了質(zhì)的飛躍。經(jīng)過近30年的研究，白云杉、黑云杉、紅云杉、歐洲云杉、庫(kù)頁(yè)云杉、西加云杉、恩氏云杉、塞爾維亞云杉等云杉屬樹種的體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)已有報(bào)道。從20世紀(jì)80年代以來，國(guó)內(nèi)相繼對(duì)原產(chǎn)我國(guó)的云杉屬樹種的體細(xì)胞胚胎發(fā)生進(jìn)行了研究，其中，青杄、白杄、紅皮云杉、沙地云杉、麗江云杉的體細(xì)胞胚胎發(fā)生究已有報(bào)道；其中挪威云杉、白云杉、黑云杉體胚發(fā)生獲得了較為深入的研究，并且已經(jīng)大規(guī)模的應(yīng)用于造林實(shí)踐中，帶來了巨大的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益。目前，挪威云杉作為云杉屬樹種的模式植物已經(jīng)開展了從細(xì)胞學(xué)水平到分子水平的全面探索，特別是全基因組測(cè)序圖譜的完成，對(duì)于闡明云杉屬樹種體細(xì)胞胚胎發(fā)生及其調(diào)控機(jī)制將發(fā)揮巨大作用。

2 體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程

植物體胚發(fā)生方式可分為兩種，即直接體胚發(fā)生和間接體胚發(fā)生。直接體胚發(fā)生即從外植體上直接誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚，間接體胚發(fā)生即需要經(jīng)過胚性愈傷組織誘導(dǎo)階段，就目前對(duì)國(guó)內(nèi)外云杉屬樹種的研究，屬于間接體胚發(fā)生，其發(fā)育階段分別為：愈傷組織誘導(dǎo)；愈傷組織保持與增殖；體細(xì)胞胚的發(fā)育與成熟；體細(xì)胞胚的萌發(fā)與植株再生；再生植株的移栽。

3 云杉屬體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程影響因素

3.1 愈傷組織誘導(dǎo)過程中的影響因素

外植體對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響：根據(jù)細(xì)胞全能性理論，植物任何細(xì)胞、組織、器官在適宜條件下，都有發(fā)育出完整新個(gè)體的可能，對(duì)許多樹種的研究表明，以未成熟胚為外植體較成熟胚具有更大的潛能。在云杉屬樹種中以未成熟合子胚成功實(shí)現(xiàn)體胚發(fā)生的居多。外植體的生理狀態(tài)也是極為重要的，因?yàn)橥庵搀w會(huì)隨著生長(zhǎng)季節(jié)而逐漸喪失胚胎發(fā)生的能力，在培養(yǎng)過程中，應(yīng)采集胚胎發(fā)生較強(qiáng)生理狀態(tài)的外植體。同時(shí)外植體的基因型對(duì)云杉屬樹種體胚發(fā)生影響較大，不同無(wú)性系外植體的同一采集時(shí)期和同一無(wú)性系的不同采集時(shí)期均會(huì)對(duì)試驗(yàn)效果產(chǎn)生巨大的影響。

培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響：基本培養(yǎng)基的成分和狀態(tài)對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生至關(guān)重要。云杉屬樹種體胚發(fā)生培養(yǎng)基較多，包括mLV、1/2mLV、LM、MS、1/2MS、改良P6培養(yǎng)基等。培養(yǎng)基的選擇影響體胚發(fā)生的培養(yǎng)效果，不適宜的培養(yǎng)基會(huì)導(dǎo)致誘導(dǎo)效果差甚至?xí)?dǎo)致試驗(yàn)的失敗。在培養(yǎng)基中氮素的形態(tài)對(duì)體胚發(fā)生起著重要的作用，通常在含有較高濃度的NH4NO3的培養(yǎng)基對(duì)體胚發(fā)生不利，明顯降低NH4+和NO3-的濃度有利于提高體胚發(fā)生率。在植物組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中是鉀離子對(duì)體胚發(fā)生是必須的，鉀離子是維持陰陽(yáng)離子平衡的主要離子。在低氮素條件下，不適當(dāng)?shù)拟涬x子濃度的影響特別明顯。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響：研究表明，影響體細(xì)胞分化的因素很多，但其中最重要的是植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)。生長(zhǎng)素是研究體胚發(fā)生最多的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，在不少植物中已經(jīng)證明是胚胎發(fā)生所必需的。2，4-D和NAA是針葉樹種體胚發(fā)生較常用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)。細(xì)胞分裂素在云杉屬樹種中也起到很重要的作用，常用的細(xì)胞分裂素有KT、TDZ和6-BA。其中6-BA作為常見。生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的種類與濃度對(duì)云杉屬樹種體胚發(fā)生具有重要的影響，二者的濃度過高或過低或比例不當(dāng)聚會(huì)對(duì)試驗(yàn)效果產(chǎn)生重要的影響。因此在試驗(yàn)過程中，應(yīng)該妥善處理植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類與濃度，以便達(dá)到更好的效果。

環(huán)境因子對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響：環(huán)境因子對(duì)體胚發(fā)生的影響也較大，環(huán)境因子、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)容器和培養(yǎng)狀態(tài)均會(huì)對(duì)體胚發(fā)生的效果產(chǎn)生重要的影響。國(guó)內(nèi)外云杉屬樹種體胚發(fā)生過程中，一般采用暗培養(yǎng)的研究方法。云杉屬樹種的體胚發(fā)生可以采用液體或固體的培養(yǎng)方法，但以固體培養(yǎng)基居多。

3.2 愈傷組織增殖過程中的影響因素

云杉屬樹種胚性愈傷組織的保持與增殖一般在生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的共同參與下進(jìn)行，生長(zhǎng)素以2，4-D和NAA最為常見，細(xì)胞分裂素是以6-BA最為常見。在此過程中，一般要降低植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的濃度，繼代周期以2周左右為宜，既能保持胚性愈傷組織的胚性，又能獲得較大的增殖量。

3.3 體胚發(fā)育與成熟過程中的影響因素

體胚發(fā)育與成熟階段一般在提高了滲透壓的培養(yǎng)環(huán)境下進(jìn)行，在云杉屬樹種中選用PEG4000居多，脫落酸（ABA）是一種天然的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，ABA對(duì)體胚發(fā)生，尤其是對(duì)體胚成熟特別重要。研究表明ABA能夠抑制胚的過早萌發(fā)對(duì)云杉屬樹種體胚成熟具有重要的影響，國(guó)內(nèi)外成功實(shí)現(xiàn)體胚發(fā)生的云杉屬樹種均在培養(yǎng)基中加入了ABA，A B A的主要作用是促進(jìn)體胚成熟，減少畸形胚的產(chǎn)生，抑制體細(xì)胞胚的過早萌發(fā)，防止針葉樹種的裂生多胚現(xiàn)象。在云杉的研究中發(fā)現(xiàn)ABA能夠促進(jìn)體細(xì)胞胚的脂類和蛋白體的積累，因而促進(jìn)體胚的成熟。

3.4 體胚的萌發(fā)與植株再生過程中的影響因素

體胚萌發(fā)即成熟的體細(xì)胞胚在適宜條件下發(fā)育成新的植株，包括成熟體胚的生根以及胚軸和子葉的伸長(zhǎng)。云杉屬樹種體胚萌發(fā)與植株再生過程一般以WPM和MS為基本培養(yǎng)基，在此過程中一般降低蔗糖的濃度，撤除植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，添加低濃度的活性炭以提高植株再生率。關(guān)于體胚的萌發(fā)狀況，不同的植株之間存在很大的差異。因此，在體胚萌發(fā)過程中，選取發(fā)育優(yōu)良的植株使很有必要的。

4 展望

體胚發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過程，包括一系列的生理生化反應(yīng)和復(fù)雜的器官發(fā)生反應(yīng)，同時(shí)影響體細(xì)胞胚胎發(fā)生的因素很多，從而給體胚發(fā)生技術(shù)的研究帶來了巨大的困難。在今后的研究中，需要在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步深化研究，要利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)分離與胚性發(fā)育相關(guān)的基因，進(jìn)一步揭示云杉屬體細(xì)胞胚胎發(fā)生分子機(jī)理及其調(diào)控機(jī)制，建立更多高效穩(wěn)定的體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生體系。這些研究將為云杉屬樹種種質(zhì)資源的保護(hù)提供理論依據(jù)，為體細(xì)胞胚胎發(fā)生在林業(yè)生產(chǎn)中的實(shí)際應(yīng)用作出貢獻(xiàn)。