SNP 分子標記技術在農(nóng)作物種子檢測中的研究與應用

李巧英 鄭戈文

（山西省農(nóng)業(yè)種子總站，太原 030006）

農(nóng)作物種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的關鍵要素，種子質量的優(yōu)劣決定著國家農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的發(fā)展，決定著人民的溫飽問題。種子質量檢測是掌握種子好壞的一個重要手段，通過檢測活動了解種子的一些特性及遺傳信息，從而進行種子的繁育、生產(chǎn)及調配。隨著農(nóng)作物種子品種數(shù)目增加，品種之間親緣關系越來越緊密，依靠傳統(tǒng)的方法和蛋白質電泳檢測已經(jīng)不能很明確地區(qū)分各品種，分子標記方法實現(xiàn)了從DNA 水平上鑒別品種，能很好地區(qū)分親緣關系較近的品種，并且通過分子檢測能夠了解各品種之間的遺傳關系，因此受到了大家的青睞，同時也是種子檢測技術發(fā)展的需要。

分子標記技術是近年來發(fā)展比較快的一種技術，第1 代分子標記和第2 代分子標記方法在種子質量檢測中發(fā)揮了必不可少的作用，但是隨著分子標記技術不斷地推廣應用，也遇到了一些問題，如試驗可重復性差，數(shù)據(jù)整合較困難，大量種子檢測工作任務繁重等。經(jīng)過不斷地研究改進，1996 年美國學者Eric S.Lander 正式提出了第3 代分子標記技術——SNP[1]，它是在SSR、ISSR 第2 代分子標記基礎上發(fā)展起來的一種標記技術。SNP 是基于PCR 技術的一種標記方法，由于其分布均勻廣泛，具有可遺傳性，穩(wěn)定性較高，并且有效地改進了第1 代、第2 代分子標記方法的缺陷，近年來在農(nóng)作物種子檢測中被廣泛研究和應用，主要用于玉米、水稻、小麥、棉花、大豆等農(nóng)作物種子的真實性檢測、純度檢測和遺傳圖譜、指紋數(shù)據(jù)庫的構建等方面。

1 SNP 分子標記技術及其特點

SNP（Single Nucleotide Polymorphism，單核苷酸多態(tài)性）是指不同生物個體在基因組DNA 序列中單個核苷酸的差異，即在生物不同品種的個體間染色體上存在單個堿基的差異，是由于基因序列中某個位置的單個堿基插入、缺失、轉換和顛倒造成的，這種差異就作為SNP 分子標記。

SNP 分子標記的本質是DNA 單堿基變異，與第1 代標記RFLP、第2 代標記SSR 的主要不同之處，RFLP、SSR 是以DNA 序列片段作為標記，SNP 是以單個堿基的變化作為標記。SNP 標記技術通過檢測分析染色體上某個位置單個核苷酸的差異，可以實現(xiàn)區(qū)分不同個體遺傳物質的差異，從而辨別不同的品種。SNP 基因分型就是用特異性的引物對某一段基因進行PCR 擴增，實現(xiàn)單堿基延伸，獲得SNP信息，通過不同技術平臺（主要包括基因芯片技術、Taqman 技術、分子信標技術和焦磷酸測序法等）檢測出SNP位點信息，與對照樣品進行比對區(qū)分品種。

SNP 分子標記技術的優(yōu)點是：單核苷酸變異，分布廣泛均勻，數(shù)量多，遺傳穩(wěn)定性高，具有代表性，通量高，檢測快，可以實現(xiàn)自動化，易于標準化操作，數(shù)據(jù)整合更簡捷，適合大規(guī)模樣品SNP 檢測研究與應用；它的缺點是：錯誤信號多，易發(fā)生假陽性，檢測成本高，同時要求在該物種全基因組測序的基礎上進行，并要求操作人員有一定的分子生物學理論基礎和實踐經(jīng)驗。

2 SNP 分子標記技術在農(nóng)作物種子質量檢測中的應用

SNP 分子標記技術由于試驗重復性好、覆蓋面廣，結果易判定，且實驗室間數(shù)據(jù)比對更容易，近年來在種子質量檢測中越來越受到大家的重視。

2.1 SNP 分子標記技術應用于種子真實性檢測種子真實性是衡量種子質量的重要指標之一，是指一批種子的特性，其所屬品種、種或屬與文件記錄（該品種審定時所描述的內容）是否一致，即品種是否名副其實。種子真實性就是解決種子的身份問題，甲品種是不是甲，有沒有被假冒，如果甲品種的種子冒充乙品種，可能會引起市場混亂、延誤農(nóng)時，或不適應播種地的氣候條件、產(chǎn)生病害或者造成減產(chǎn)。種子真實性檢測就是通過檢驗種子身份，了解種子的特性，使各品種因地制宜發(fā)揮其優(yōu)勢，應用SNP 分子標記技術檢測種子真實性，更加快速高效。李雪等[2]比較SSR 和SNP 標記方法在玉米種子真實性鑒定中的應用，選擇了11 套玉米種子雜交種和親本進行試驗，用40 對SSR 引物和3072 個SNP 位點的數(shù)據(jù)，比較分析各個參數(shù)，結果表明，這2 種方法在種子真實性鑒定方面具有較好的一致性；陸靜姣等[3]用SNP 標記對南方104 個秈型兩系雜交水稻親本進行遺傳差異性研究，發(fā)現(xiàn)SNP 標記分析的水稻品種間遺傳差異與系譜分析結果一致性很高；陳廣鳳等[4]通過SNP 分子標記方法，對中國冬麥區(qū)205 份小麥育成品種進行基因分型，研究小麥遺傳多樣性。試驗結果證實，SNP 標記方法檢測種子真實性，在品種區(qū)分能力、位點穩(wěn)定性及遺傳關系分析等方面簡捷有效，結果準確可靠。

2.2 SNP 分子標記技術應用于種子純度檢測種子純度是一個品種在特征特性方面典型一致的程度，不同品種在外觀表現(xiàn)及田間生長特性等方面有很大差異，種子純度檢測通常采用田間小區(qū)種植鑒定和蛋白質電泳方法。田間小區(qū)種植鑒定受自然環(huán)境條件和人為主觀因素的影響，不能保證檢測結果的及時性和準確性；蛋白質電泳方法檢測受親緣關系遠近和遺傳基礎條件的影響不能明確鑒別出異品種。利用SNP 標記方法進行種子純度檢測，可以從分子水平上鑒定種子特性的一致性，結果準確且效率高。吳明生等[5]利用1 個多態(tài)性SNP 位點，分析5 個雜交玉米組合，發(fā)現(xiàn)該位點可以將其中2 個雜交玉米品種中混雜的親本區(qū)分出來，結果準確；匡孟等[6]基于KASP 技術，利用SNP 標記方法，從63K的棉花全基因組芯片中，選出26 個雜合率高且分型效果理想的SNP 核心位點，進行棉花雜交種純度檢測；蘭青闊等[7]經(jīng)試驗篩選出SNP 位點CLA6（A/G），結合焦磷酸測序技術，建立黃瓜雜交種純度鑒定方法，研究結果與SSR 方法鑒定結果一致。金名捺等[8]利用水稻全基因組9K SNP 芯片對栽培稻品種黃華占和野生稻Y605 進行掃描，尋找兩者之間的SNP 位點，并將其開發(fā)成基于HRM 技術的特異分子標記。利用這些標記對黃華占與野生稻Y605的BC3F1和BC3F2群體進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)它們都能準確區(qū)分親本的純合與雜合基因型。研究表明，SNP 標記方法檢測種子純度，克服了環(huán)境和人員因素的影響，能從DNA 水平上將親緣關系較近的和遺傳關系復雜的異品種明確地辨別出，并且適合大量樣本的檢測，因此具有廣闊的應用前景。

2.3 SNP 分子標記技術在其他方面的應用目前SNP 分子標記技術在農(nóng)作物品種遺傳圖譜、數(shù)據(jù)庫構建等方面的研究應用非常廣泛，在小麥、油菜、大豆、甘藍等作物中均有報道。高尚等[9]用90K SNP 基因芯片技術，對包含188 個家系的小麥群體進行分析，構建小麥高密度遺傳圖譜；趙仁欣等[10]通過SNP 芯片分析224 份國家甘藍型油菜品種，用60K SNP 芯片進行基因分型，篩選得到5374 個SNP 標記，且這些標記在油菜全基因組上分布均勻、多態(tài)性高、區(qū)分度好，用于構建甘藍型油菜品種DNA 指紋圖譜；譚瑞娟等[11]通過50 個多態(tài)性SNP 標記位點，研究分析不同的大豆品系，構建大豆基因組遺傳圖譜；李志遠等[12]利用SNP 標記分析59 個甘藍品種，篩選出417個在染色體上均勻分布、多態(tài)性較好的SNP 位點，作為構建DNA 指紋圖譜的核心標記，獲得甘藍品種SNP 指紋圖譜。遺傳圖譜的構建為鑒定分析農(nóng)作物品種的真實性、特異性提供了依據(jù)。我國農(nóng)作物品種SNP 指紋數(shù)據(jù)庫的構建正在進行中，玉米、水稻、小麥、棉花等農(nóng)作物種子的數(shù)據(jù)庫信息在不斷完善中，油菜、番茄、辣椒等蔬菜種子的信息也在收集整理中。SNP 分子標記技術進行農(nóng)作物種子質量檢測的相關標準正在陸續(xù)制訂與頒布，已經(jīng)頒布的有NY/T 2745-2015《水稻品種鑒定 SNP 標記法》。

3 展望

在分子生物技術迅猛發(fā)展的時代，分子標記技術推陳出新，SNP 標記作為新一代的標記方法，具有更多的技術特點，集合了DNA 提取程序化、電泳分析自動化、數(shù)據(jù)整合標準化，與數(shù)據(jù)庫信息比對，分析速度更快、信息更全面、結果更可靠。隨著SNP技術的研究與探索，檢測技術和分析手段不斷地改進與完善，特異性引物的開發(fā)與共享，假陽性、高成本等問題的解決，SNP 技術在種子質量檢測的推廣應用中，將會發(fā)揮更大的技術優(yōu)勢，極大地提高檢測工作效率，為保障農(nóng)民用種安全，維護企業(yè)合法權益，確保種子市場健康有序提供強有力的技術支撐。