法醫(yī)物證檢驗中常染色體STR位點突變的研究進展

趙佩翔，陳鵬宇，余麗梅

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 貴州省細胞工程重點實驗室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 司法鑒定中心，貴州 遵義 563099)

短串聯(lián)重復(fù)序列(Short tandem repeat，STR)分型技術(shù)具有高靈敏度、高鑒別能力、高種屬特異性、結(jié)果高度準(zhǔn)確性、易于標(biāo)準(zhǔn)化等特點，如今已作為個人識別以及親權(quán)案件中的鑒定金標(biāo)準(zhǔn)。自1997年美國FBI設(shè)立聯(lián)合檢索系統(tǒng)(Combined DNA Index System，CODIS)以來，STR就作為第二代遺傳標(biāo)記并沿用至今。近年以來，CODIS核心基因工作組(CODIS core Loci Working Group)對核心基因座進行了補充，增加了7個核心基因座(包括D2S1338、D19S433、D1S1656、D12S391、D2S441、D10S1248以及DYS391)，并且剔除了TPOX基因座形成了19個新的CODIS核心基因座[1]。

與性染色體相比，23對常染色體中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用的STR位點數(shù)量十分龐大，聯(lián)合PCR-STR技術(shù)能夠提供大量基因座的等位基因信息，在這樣的復(fù)合擴增系統(tǒng)中累計個人識別力(the combined power of discrimination,CPD)及累計非父排除率(the combined power of exclusion,CPE)都能滿足司法鑒定的系統(tǒng)效能要求，從而為法醫(yī)物證檢案提供可靠豐富的數(shù)據(jù)來源[2]。同時，在親權(quán)案件中，性染色體STR主要作為輔助指標(biāo)，選擇性染色體也會受到被鑒定人的性別的影響，常常較局限，而常染色體STR適用大部分親權(quán)鑒定案件類型，是公安、司法鑒定中心以及第三方檢測機構(gòu)在刑事偵查、親權(quán)鑒定、個人識別等法醫(yī)物證領(lǐng)域首選的遺傳標(biāo)記。

1 STR突變的法醫(yī)學(xué)意義

實際工作中發(fā)現(xiàn)，貴州漢族人群中STR等位基因是具有良好的多態(tài)性[3]，同時STR的突變也時有發(fā)生，其實質(zhì)是STR的等位基因在親代與子代之間不符合遺傳規(guī)律的現(xiàn)象。理論上，親權(quán)鑒定案件當(dāng)中選用的STR基因座突變率較低，這是因為基于孩子與親代的等位基因在遺傳過程中能夠保持穩(wěn)定遺傳的假設(shè)，通常每1 000減數(shù)分裂發(fā)生1～4次突變[4](突變率為0.1%～0.4%)。然而在計算累計親權(quán)指數(shù)(Combined paternity index，CPI)時必須考慮STR突變的影響，因為等位基因的突變可能會使CPI達不到行業(yè)認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)，鑒定人員將無法給出肯定的判定意見，甚至在13個CODIS基因座基礎(chǔ)上，不斷增加到15、19、23個常染色體STR基因座，也不能完全得到支持或不支持的親權(quán)關(guān)系鑒定意見，對日常工作造成了不能回避的風(fēng)險[5-7]，應(yīng)該引起司法鑒定科研人員的重視。此外后天環(huán)境或疾病因素導(dǎo)致STR分型結(jié)果發(fā)生改變已經(jīng)為研究所證實，這些原因?qū)Ψㄡt(yī)學(xué)判斷突變造成一定的影響。因此，在親權(quán)鑒定中，必須了解STR突變的國內(nèi)外研究進展，本文從突變機制與模式、突變特征、主要影響因素以及最大連續(xù)同一重復(fù)次數(shù)(longest run of perfect repeats，LRPR)、雜合性丟失等綜述了常染色體STR突變的研究進展，為法醫(yī)物證的準(zhǔn)確判斷和科學(xué)研究提供理論參考。

2 STR突變的主要機制

目前廣大學(xué)者普遍接受的STR突變機制最適宜的解釋是DNA復(fù)制滑動(replication slippage)或稱滑動錯配，即若雙鏈DNA的堿基構(gòu)成近似的情況下，在DNA復(fù)制過程中雙鏈分離時，STR的重復(fù)區(qū)域內(nèi)容易出現(xiàn)一個或數(shù)個堿基錯配的重復(fù)區(qū)域的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這種因為錯配形成的堿基環(huán)可能導(dǎo)致新生鏈堿基數(shù)目的增加或減少，表現(xiàn)為重復(fù)單位的插入或缺失，這與重復(fù)單位的側(cè)翼序列、重復(fù)單位及待擴增等位基因的長度有關(guān)。另外發(fā)生在染色體聯(lián)會時期的不等交換(unequal crossing over)也可能在STR突變中產(chǎn)生一定作用，但就STR突變而言DNA滑動錯配比不等交換更常見[8]。

逐步突變模式(Stepwise mutation model，SMM)是STR突變模式中的重要支持理論，即認(rèn)為STR的突變是以一步突變?yōu)橹鳎嗖酵蛔兪窃谝徊酵蛔兊幕A(chǔ)上逐步形成，突變的步數(shù)越多，相對發(fā)生的機會也就越小，每次STR突變按照一定的突變幾率增加或者減少一個重復(fù)單位[1,4]。事實上逐步突變理論存在一定缺陷，根據(jù)該理論假說，在一定的突變幾率下STR可以無限增減重復(fù)單位，但在實際研究點突變與復(fù)制滑動機制關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，在低于復(fù)制滑動閾值(5 ～9個重復(fù)單位)時，點突變?yōu)橹鲗?dǎo)突變機制，而在較長的重復(fù)序列長度(大于10個重復(fù)單位)中，復(fù)制滑動機制占主導(dǎo)地位。因此，在STR的突變中以滑動錯配和逐步突變?yōu)橹饕獧C制。

3 STR突變特征

3.1 突變率是研究突變的首要指標(biāo) 突變率是突變案件中親權(quán)判定的重要指標(biāo)，對鑒定結(jié)果的判定有著重要的意義。目前國內(nèi)外關(guān)于STR突變分析研究中都首先報道各基因座突變率，民族不同，基因座突變率也不同，甚至在某些基因座中突變率相差較大[2]。比較中國西南、南、北方三個地區(qū)漢族突變率，發(fā)現(xiàn)這些地區(qū)突變率最高的基因座依次是FGA、D18S51和Penta E，突變率較低都是TPOX和TH01基因座[9]。可見，突變率較直觀反應(yīng)被研究群體的突變特征的指標(biāo)。但是突變率的計算與觀察依然與樣本量的選擇有著直接的關(guān)系，關(guān)于突變的研究已有不少報道，但是對總樣本量的選擇上卻有很大出入，這使得通過減數(shù)分裂次數(shù)計算的突變率差異會較大，不排除存在假陽性和假陰性的計算結(jié)果。

3.2 核心序列特征 STR突變的另一個主要特征表現(xiàn)在核心序列上，即基序(Motif)的變化特征，基序是指重復(fù)序列堿基組成的形式，STR突變通常表現(xiàn)為基序的插入或缺失。研究發(fā)現(xiàn)，常染色體STR的突變，主要以一步突變?yōu)橹?，多步突變幾率相對較小，同時需值得一提的是即便是單基因座三步以上突變的案例在鑒定意見的撰寫時需考慮回避風(fēng)險。另外在一步突變中插入/缺失突變比例在不同人群中差異卻較大，如廣州中山漢族人群該比例為1.2∶1(n=376)[10]，而浙江杭州漢族人群則為1.7∶1(n=195)[11]，同樣在云南昆明漢族人群插入/缺失比例沒有顯著差異[12]。也有研究觀察到突變次數(shù)最大的FGA基因座發(fā)生突變高達25次，較小的等位基因表現(xiàn)為基序的插入突變，較大的等位基因傾向于基序的缺失突變,這種現(xiàn)象在Y-STR中也有類似研究報道[7]。因此，STR突變在突變步數(shù)、插入/缺失比例、突變趨勢有著自己獨特的特征，而這些特征在不同的人群中有著一定的差異，一定程度上可以間接地反應(yīng)的群體多態(tài)性的特征。

4 STR突變的主要影響因素

在突變研究中，除了對群體的突變率、突變特征之外，還需要進一步考慮影響STR突變的主要影響因素,如民族、地理環(huán)境、雜合度、等位基因長度及親代的年齡、性別，甚至需要考慮細胞的分裂活躍程度與腫瘤等疾病狀態(tài)等許多因素的作用[13]。

4.1 民族與地域不同會導(dǎo)致突變存在差異 人類走出非洲大陸，經(jīng)過了數(shù)次大規(guī)模的遷移活動，隨著時間的變遷，如今人類已經(jīng)遍布了全世界的每一個角落。然而相同地區(qū)不同民族，不同地區(qū)同一民族或者不同地區(qū)不同民族的人群會因為其地理環(huán)境、民族風(fēng)俗的差異而被相對隔離在相對穩(wěn)定的區(qū)域內(nèi)，與其它地域內(nèi)人群相比，既可能存在因祖輩累計遺傳的某些特定基因的差異，也可能存在民族之外的地域?qū)z傳及突變所造成的突變率、STR核心序列、重復(fù)次數(shù)等特征的改變。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)多維標(biāo)度(Multidimensional scaling)圖能夠?qū)⒌乩砦恢孟鄬拷娜巳号c其它相對較遠的人群區(qū)分開，反應(yīng)出地理位置遠近與人群STR基因特征存在的差異[14-15]。同時需要注意的是，現(xiàn)階段的突變分析僅是針對某一時段內(nèi)某一地區(qū)的某一人群內(nèi)進行研究，隨著人口的遷移，交通日趨發(fā)達，城市規(guī)模逐漸擴大乃至國際通婚率的提高，STR突變分析也應(yīng)是一個隨著時間推移不斷更新的復(fù)雜動態(tài)過程。

4.2 雜合度與突變率的相關(guān)關(guān)系 雜合度(Heterozygosity)是指在群體中某個遺傳標(biāo)記的全部基因型中雜合子所占的比例，除了用于群體多態(tài)性研究，同樣也用于等位基因突變的相關(guān)分析，雜合度越大表明該基因座在法醫(yī)應(yīng)用中的價值越大。研究發(fā)現(xiàn)，各個基因座的期望雜合度(Expected heterozygosity，He)與該基因座突變率存在一定正相關(guān)關(guān)系[16]，即期望雜合度越大的基因座，突變率也就越高，我們知道期望雜合度的計算公式為(n為樣本中等位基因或單倍型的總數(shù)，k為等位基因或單倍型的數(shù)目，pi為樣本中等位基因或者單倍型的頻率)。通過公式就能直觀的反應(yīng)，等位基因pi值應(yīng)該符合該地區(qū)等位基因分布理論頻率，而研究總?cè)后w的等位基因總數(shù)n的大小也對雜合度有重要影響。但在研究過程中，有不少研究人員僅統(tǒng)計了一個商品化STR試劑盒的突變案例，在樣品量不夠大的情況下，會發(fā)現(xiàn)很多基因座的突變率計算結(jié)果相等，而加上各個基因座雜合度差異不是很大，因而很難得出二者相關(guān)關(guān)系的有效證據(jù)。

4.3 LRPR與突變率的相關(guān)關(guān)系 LRPR實質(zhì)是指計算基因座核心序列能完整或完全重復(fù)的次數(shù)，如某基因座的等位基因有9、10、10.1、12.3，則LRPR記為9、10、10、12。在法醫(yī)學(xué)中，由于樣本來源不同或樣本例數(shù)的限制，所得到的STR某基因座的等位基因也會不盡相同，那么LRPR取值也將不同，研究中通常取某基因座全部LRPR的幾何均數(shù)(geometric mean of the longest run of perfect repeats，GEO)，發(fā)現(xiàn)該幾何均數(shù)與對應(yīng)基因座的突變率存在一定相關(guān)關(guān)系[17]。LRPR的幾何均數(shù)值越大，可以理解為核心序列完整重復(fù)次數(shù)越多，對應(yīng)基因座的突變率越高。

4.4 父源性突變顯著大于母源性突變 親代性別作為影響因素的實質(zhì)是判斷STR突變來源，根據(jù)《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》(SF/Z JD0105001-2016)規(guī)定，在累計親權(quán)指數(shù)大于10 000的情況下，可給予支持符合親權(quán)關(guān)系的結(jié)論，則案件中不符合遺傳規(guī)律的基因座可視為STR發(fā)生突變，隨即需要判斷突變來源，在三聯(lián)體案件中，通常根據(jù)新產(chǎn)生的等位基因與父親、母親的等位基因比較，將距突變等位基因差異最小的一方基因定為子代等位基因的突變來源，若差異相同，則無法確定來源，所以STR突變來源可以分為“來自父親”“來自母親”和“無法確定”3種情況。大量研究已經(jīng)明確“來自父親”的突變顯著高于“來自母親”的突變[18]。這是因為卵(精)原細胞在形成卵母細胞和精細胞之前都會有DNA的復(fù)制以及細胞有絲分裂過程，再經(jīng)過減數(shù)分裂形成配子，成年男性精子有絲分裂的次數(shù)顯著高于性成熟的女性個體，使得男性生殖細胞DNA復(fù)制量最高可比女性生殖細胞的DNA復(fù)制量高出數(shù)十倍，意味著男性在配子形成過程中STR基因座發(fā)生突變的機會顯著高于女性。同時，也有研究報道，精細胞上的PEDM9基因控制基因重組的過程，并與減數(shù)分裂不穩(wěn)定性有關(guān)[19-20]，這種潛在的機制很可能是父源突變率高的根本原因之一。

4.5 親代年齡與突變 親代年齡主要指孩子出生時父母的實際年齡，也是STR突變中的重要影響因素，在精細胞形成過程中年齡較大的被檢父會經(jīng)歷更多的細胞分裂，DNA復(fù)制次數(shù)也更多，相對發(fā)生突變的幾率也會增大，在實際親子鑒定案例中，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)隨著被檢父年齡的增大，突變率也在不斷增加，二者呈現(xiàn)高度相關(guān)關(guān)系(︱r︱=0.99)[12]。而在母源性突變中很難見到隨著年齡增長突變率遞增的趨勢。

5 判斷STR突變需警惕雜合性丟失現(xiàn)象

沉默基因(silent allele)的產(chǎn)生可能會導(dǎo)致雜合性丟失(loss of heterozygosity，LOH)的發(fā)生，即基因組正常的一對等位基因發(fā)生了某種變化，使得其中一條等位基因在擴增時丟失。Akiko Tsuji等人在研究D19S433基因座中發(fā)現(xiàn)[21]，測序結(jié)果顯示孩子D19S433基因座為重復(fù)序列下游第32個核苷酸發(fā)生了G→A點突變，而STR分型結(jié)果為15的純合子，與父親13,13、母親14,15的STR分型結(jié)果的遺傳規(guī)律不符合，可能被誤判為STR的突變，而導(dǎo)致錯誤的PI計算。有研究對類似情況的STR基因座峰高進行了仔細比較后發(fā)現(xiàn)，由于D19S433的等位基因大小101～148bp，vWA等位基因大小為151～203bp，兩者大小較接近，故而D19S433的總峰高與vWA的總峰高接近(樣本為雜合子，峰高取兩峰高總和)，當(dāng)D19S433出現(xiàn)沉默基因，導(dǎo)致LOH時，D19S433的峰高明顯低于vWA基因座[22]。除了早期在TH01、FGA、vWA基因座上發(fā)現(xiàn)LOH[23-25]，近年來在D5S818、D13S31基因座上相繼發(fā)現(xiàn)因為沉默基因[26-27]，LOH導(dǎo)致單個基因座不符合遺傳規(guī)律的報道。這種因為沉默基因所致LOH，使得雜合子的基因型在分型中變成純合子參與親權(quán)指數(shù)的計算，勢必對鑒定意見產(chǎn)生影響，因此鑒定人日常工作檢案中發(fā)現(xiàn)基因座不符合遺傳規(guī)律時，需警惕樣本中基因型為純合子，且峰高明顯低于同批樣本同基因座峰高，或出現(xiàn)純合子多步突變的情況時也需謹(jǐn)慎分析，避免將LOH誤判為突變。

另外，在實際檢案中很難在取材時就已明確檢材是否來源于早期實體腫瘤患者，或者其他早期惡性血液病患者，F(xiàn)iloglu G等[28]人在針對急、慢性白血病患者的STR分型研究中，經(jīng)血液和口腔分別取材，在100名患者中發(fā)現(xiàn)了2名患者存在LOH和基因不穩(wěn)定的現(xiàn)象。另一項在胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌患者的STR分型研究中[29]，采用冰凍保存和甲醛固定石蠟包埋的組織得到相同的STR分型結(jié)果，同樣發(fā)現(xiàn)了LOH的現(xiàn)象。這些研究揭示了LOH直接原因并不是STR發(fā)生了傳統(tǒng)意義的重復(fù)序列的增加或減少的突變，經(jīng)過測序技證實為單核苷酸點突變導(dǎo)致。

因此，在接受復(fù)雜檢案時，鑒定人無法判斷檢材是否來源于健康個體，或者檢材是否經(jīng)過復(fù)雜處理，這些因素都有可能導(dǎo)致STR分型出現(xiàn)偏差，這提醒司法鑒定人在處理復(fù)雜檢材的時候需要綜合SNP、Indel及測序技術(shù)等新技術(shù)判斷，否則在親權(quán)鑒定中將LOH誤判為STR發(fā)生遺傳突變，這極有可能對案件的結(jié)論造成不能避免的錯誤判斷。

6 展望

STR基因座突變是普遍存在的現(xiàn)象，影響STR突變的因素多樣且復(fù)雜，為了確保檢案鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，在親子及親緣關(guān)系鑒定中，必須全面考慮所有符合與不符合孟德爾遺傳規(guī)律的等位基因，正確分析突變，計算CPI，最終給出“支持”或者“排除”的鑒定意見，若達不到認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)，則需要額外增加常染色體STR基金座進行檢測，甚至將Y-STR或X-STR作為補充；同時也需綜合考慮檢材身源者的民族、性別、年齡和基因座的LOH及突變頻率等，尤其是特殊疾病患者或經(jīng)過特殊處理的檢材，更需謹(jǐn)慎分析STR分型結(jié)果。復(fù)雜檢案中，還可以聯(lián)合應(yīng)用SNP、Indel等遺傳標(biāo)記系統(tǒng)或二代測序技術(shù)等檢測手段，排除復(fù)雜因素的干擾，以確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，降低誤判風(fēng)險。

隨著STR突變數(shù)據(jù)的不斷積累，研究STR的突變也是對DNA數(shù)據(jù)庫的重要補充，有利于完善法醫(yī)物證學(xué)領(lǐng)域的理論體系，對復(fù)雜、疑難檢案的準(zhǔn)確判定具有重要指導(dǎo)意義。