禽腺病毒Hexon蛋白多克隆抗體制備及特異性鑒定

牛玉娟,孫芹芹*,趙君,孫偉,張會霞 張桂華,肖一紅,商營利,劉思當(dāng)**

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禽腺病毒Hexon蛋白多克隆抗體制備及特異性鑒定

牛玉娟1,2,3,孫芹芹1,2,3*,趙君1,2,3,孫偉4,張會霞1,2,3張桂華1,2,3,肖一紅1,2,3,商營利1,2,3,劉思當(dāng)1,2,3**

1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院, 山東 泰安 271018 2. 山東省動物生物工程與疾病防治重點實驗室, 山東 泰安 271018 3. 山東省畜禽疫病防制工程技術(shù)研究中心, 山東 泰安 271018 4. 蓬萊市小門家獸醫(yī)站, 山東 煙臺 265603

本研究旨在制備禽腺病毒（FAdV）Hexon蛋白多克隆抗體并對其特異性進行分析鑒定。通過構(gòu)建重組的原核表達載體pET-28a-Hexon，轉(zhuǎn)入表達菌BL21 (DE3)，IPTG誘導(dǎo)，并運用SDS-PAGE進行重組蛋白的鑒定，最后純化蛋白。利用純化的融合蛋白進行常規(guī)新西蘭大白兔免疫，以制備Hexon蛋白的多克隆抗體。采用間接免疫熒光、免疫組織化學(xué)和Western blot的方法鑒定多克隆抗體的特異性。結(jié)果表明，Hexon蛋白的原核表達量較高，并且是以包涵體的形式存在，分子質(zhì)量大小約為43 kDa；免疫兔后獲得能與FAdV發(fā)生特異性反應(yīng)且高效價的多克隆抗體。因此，本試驗制備的FAdV Hexon蛋白的多克隆抗體證明特異性良好，為后期禽腺病毒病的診斷、致病機制研究及亞單位疫苗的研制提供了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。

禽腺病毒;基因; 多克隆抗體; 特異性

禽腺病毒(fowl adenovirus, FAdV) 依據(jù)抗原的不同分為3個群，其中Ⅰ群腺病毒又可分為5個亞群（A~E）、12個血清型(FAdV-1至8a和8b至11)[1]。1963年和1987年分別在美國和巴基斯坦爆發(fā)了包涵體肝炎?。╥nclusion body hepatitis，IBH）和心包積液綜合征?。╤ydropericardium syndrome，HPS）[2,3]，主要侵害雛雞，多呈急性經(jīng)過，使世界養(yǎng)禽業(yè)遭受滅頂之災(zāi)[4-7]。我國于1976年首先在臺灣省發(fā)現(xiàn)禽腺病毒感染[8]，隨后在遼寧、山東、內(nèi)蒙古等多個省份相繼發(fā)現(xiàn)IBH的流行[9-11]，2015年爆發(fā)了HPS[12]。

迄今為止，國內(nèi)在該病毒的致病性機制、血清學(xué)診斷方法及亞單位疫苗開發(fā)等方面的研究未見報道。鑒于此，本研究從心包積液綜合征臨床病例中分離得到FAdV，克隆其衣殼蛋白-Hexon部分基因，構(gòu)建重組原核表達載體pET-28a-Hexon，轉(zhuǎn)入表達菌BL21 (DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達。

六鄰體蛋白（Hexon蛋白）是腺病毒的主要結(jié)構(gòu)衣殼蛋白之一，也是主要的屬和亞屬特異性抗原決定簇和次要的種特異性抗原決定簇。根據(jù)六鄰體的三維結(jié)構(gòu)模式，幾個比較大的抗原表位區(qū)都位于前段loop1和中段loop2，具有型和群的特異性表位，能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的抗體[11,12]。因此，運用軟件預(yù)測loop1和loop2中免疫原性較強的一段序列，進行常規(guī)的原核表達，制備免疫原，而后對新西蘭大白兔進行了三次免疫，以制備抗FAdV Hexon蛋白兔的多克隆抗體。制備特異性強且高效的多克隆抗體可為進一步開展FAdV流行病學(xué)調(diào)查、疾病診斷、致病機制研究和亞單位疫苗研制提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

禽腺病毒血清4型（FAdV-4）SDDM-4/15株、血清8b型（FAdV-8b）和血清11型（FAdV-11）由本實驗室分離、鑒定并保存；pET-28a原核表達載體為本實驗室提供；病毒DNA提取試劑盒和BL21(DE3)感受態(tài)細胞均來自北京全式金生物技術(shù)有限公司；rTag酶和限制性內(nèi)切酶H I和d III均購自寶生物工程（大連）有限公司；FITC-羊抗兔二抗及DAB顯色試劑盒購自北京康為生物技術(shù)有限公司；Ni- NTA純化蛋白柱子購自南京金斯瑞生物科技有限公司；ELC顯色液購自上海文淵閣生物科技有限公司；原代雞胚腎細胞（CEK）；雞肝癌細胞（LMH）購自ATCC；胎牛血清購自BI公司。體重2.5 kg左右的新西蘭大白兔購自濟南實驗動物有限公司。

1.2 FAdV-4 Hexon基因的原核表達和純化

取病毒培養(yǎng)上清，采用病毒DNA提取試劑盒提取病毒基因組DNA，作為FAdV-4基因擴增模板。用DNA star軟件預(yù)測n基因中免疫原性較強的一段序列（385-1419），并用Primers 6.0 軟件根據(jù)參考序列（Gene Bank 登錄號：KDA877411）設(shè)計特異性引物（小寫部分為酶切位點），F(xiàn): 5′-CGggatccCTGGCTCCCAAGGAGTCCATGTTT-3′（引入H I酶切位點）；R: 5′-CCCaagcttGACGCGCTTGTTCATGTACTCGTAG-3′（引入d III酶切位點），擴增1052 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)H I和d III雙酶切后與經(jīng)同樣酶切的pET-28a進行連接，并轉(zhuǎn)化入BL21 (DE3)感受態(tài)細胞，陽性克隆采用雙酶切鑒定和序列測定分析，重組陽性質(zhì)粒命名為pET-28a-Hexon。將雙酶切與測序結(jié)果正確的陽性菌接種于新鮮的LB培養(yǎng)基中，活化擴大培養(yǎng)2~3 h，用終濃度為1 mmol/L的IPTG 37 ℃誘導(dǎo)表達3 h。將陽性菌液經(jīng)13000 r/min 4 ℃離心15 min后，用少量的PBS重懸菌體，然后進行超聲破碎后，離心取上清和沉淀，用SDS-PAGE檢測目的蛋白的在上清和沉淀中的表達。取超聲破碎后的包涵體，加入8 mmol/L的尿素溶解，利用Ni-NTA純化試劑盒純化融合蛋白，純化后的目的蛋白SDS-PAGE鑒定后，放于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 兔抗雞Hexon多克隆抗體的制備

初次免疫時，將鑒定純化好的融合蛋白與弗氏完全佐劑按1:1充分混勻乳化，進行背部皮下多點注射3只兔子（1 mg/只）。以后每2周用弗氏不完全佐劑與純化蛋白1:1混勻皮下注射，加強免疫2次。最后一次免疫一周之后，采血分離血清作為一抗，至-80 ℃保存。

1.4 間接免疫熒光鑒定多克隆抗體特異性

分別將FAdV-4 (SDDM-4/15)、FAdV-8b和FAdV-11接種CEK，病毒侵染3 d，觀察到攻毒的細胞形成明顯典型的細胞病變，采用多聚甲醛固定細胞，按常規(guī)間接免疫熒光步驟進行分析鑒定。一抗為1:200倍稀釋，37 ℃孵育1 h，PBS洗3次，分別加入二抗為FITC標記的羊抗兔IgG（1:300倍），37 ℃孵育1 h，PBS洗3次后，每孔加入50mL PBS溶液，置熒光顯微鏡下觀察。

1.5 免疫組織化學(xué)鑒定多克隆抗體的特異性

將之前進行FAdV-4攻毒試驗第4天固定的各個臟器進行常規(guī)石蠟切片[10]，之后按照常規(guī)的免疫組織化學(xué)步驟進行染色，切片孵育兔多克隆抗體（1:100倍），4 ℃過夜孵育，HRP標記的羊抗兔IgG (1:800倍)，37 ℃孵育1 h，最后用DAB顯色試劑盒顯色。陰性對照用未免兔血清代替一抗。

1.6 Western blot 鑒定多克隆抗體的特異性

將MOI為10的FAdV-8b、FAdV-11和FAdV-4接種LMH，待接毒36 h后，收集細胞，裂解進行Western blot分析鑒定。一抗為1:5000倍稀釋的兔抗Hexon的多克隆抗體，二抗為HRP標記的羊抗兔IgG（1:5000倍），ECL顯色。

2 結(jié)果

2.1 FAdV-4 部分Hexon基因的PCR擴增

以提取的FAdV-4基因組為模板，經(jīng)過PCR擴增獲得了與預(yù)期大小相符的1052 bp片段（圖1A）。之后PCR和I和III雙酶的鑒定結(jié)果（圖1B）均顯示重組表達質(zhì)粒pET-28a-Hexon構(gòu)建成功，測序結(jié)果也證實插入的目的基因大小正確且閱讀框沒有移碼。

圖 1 FAdV-4 Hexon部分基因PCR擴增電泳圖及重組表達載體pET-28a-Hexon雙酶切鑒定電泳

A：M. DL2000 DNA Marker； 1. FAdV-4部分基因擴增產(chǎn)物1052bp； B：M. DL5000 DNA Marker；1. pET-28a載體；2. 重組pET-28a-Hexon雙酶切產(chǎn)物。

A: M. DL2000 DNA Marker; 1, FAdV-4partial gene amplification product 1052bp. B: M. DL5000 DNA Marker; 1. pET-28a plasmid; 2. Recombinant pet-28a-bienzymatic product.

2.2 融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中的誘導(dǎo)表達及純化

經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳驗證發(fā)現(xiàn)（圖2A），誘導(dǎo)后的pET-28a-Hexon在約43 kDa處有1條與預(yù)期大小相符的特異蛋白帶，而誘導(dǎo)前后pET-28a和誘導(dǎo)前的pET-28a-Hexon卻沒有相應(yīng)條帶，這與預(yù)期結(jié)果是一致的，說明融合蛋白誘導(dǎo)表達成功。通過比較上清與沉淀的包涵體蛋白條帶發(fā)現(xiàn)，絕大部分融合蛋白存在于沉淀包涵體中，而上清中僅有極少量甚至沒有該融合蛋白，說明原核表達的該蛋白主要是以包涵體的形式存在菌體內(nèi)。

超聲波破碎重組誘導(dǎo)的菌體，離心分離包涵體，用Ni-NTA純化重組蛋白pET-28a-Hexon，SDS-PAGE結(jié)果表明純化效果較好（圖2B），純化的蛋白可以作為抗原免疫兔子。

圖 2 重組蛋白FAdV-4 Hexon的表達及鑒定

A：M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準； 1. pET-28a誘導(dǎo)前；2. pET-28a誘導(dǎo)后； 3. 重組pET-28a-Hexon誘導(dǎo)前；4. 重組pET-28a-Hexon誘導(dǎo)后；B：M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準； 1. pET-28a-Hexon誘導(dǎo)后超聲裂解上清；2. pET-28a-Hexon誘導(dǎo)后超聲裂解包涵體；3. 融合蛋白純化時流出液；4. 融合蛋白純化的洗脫液。

A: M. Protein relative molecular mass standard; 1. Before the induction of pET-28a; 2.After the induction of pET-28a; 3.Before the induction of recombinant pET-28a-Hexon; 4. After the induction of recombinant pET-28a-Hexon. B: M. Protein relative molecular mass standard; 1. Supernatant of induced pET-28a-Hexon with sonication; 2. Inclusion bodies of induced pET-28a-Hexon with sonication; 3. Fusion protein efflux; 4. Elution solution for fusion protein purification

2.3 間接免疫熒光鑒定多克隆抗體的特異性

間接免疫熒光結(jié)果顯示，pET-28a-Hexon重組菌誘導(dǎo)表達的Hexon蛋白免疫兔子，制備的多克隆抗體，1:200倍稀釋能夠與FAdV-4發(fā)生特異性反應(yīng)發(fā)出亮綠色熒光，與FAdV-8b和FAdV-11不發(fā)生發(fā)應(yīng)（圖3）。陰性對照兔血清與FAdV-4、FAdV-8b和FAdV-11都不發(fā)生反應(yīng)（未提供圖）。因此，所制備的兔多克隆抗體能夠特異的結(jié)合FAdV-4。

圖 3 IFA鑒定兔多克隆抗體的特異性

A：CEK細胞感染FAdV-4 (400×)；B：CEK感染FAdV-8b (200×)；C：CEK感染FAdV-11 (200×)；D：正常的CEK (200×)。

A: CEK infected with FAdV-4 (400×); B: CEK infected with FAdV-8b (200×); C: CEK infected with FAdV-11 (200×); D: Uninfected CEK (200×).

2.4 免疫組織化學(xué)鑒定多克隆抗體的特異性

免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，pET-28a-Hexon重組菌誘導(dǎo)表達的Hexon蛋白免疫兔子，制備的多克隆抗體，1:100倍稀釋能夠與FAdV-4特異性結(jié)合，在肝、胰腺、腺胃、腸道、心、肺、腎、脾組織切片中看到褐色陽性顆粒（圖4）；用陰性兔血清作為一抗卻無特異性著色（未提供圖）。

圖 4 IHC鑒定兔多克隆抗體特異性

A：肝 (400×)；B：胰腺(400×)；C：腺胃(400×)；D：小腸(400×)；E：心臟(400×)；F：肺臟(400×)；G：腎臟(400×)；H：脾 (400×)。

A: Liver (400×); B: Pancreas (400×); C: Glandular stomach (400×); D: Epithelial cells in the intestine (400×); E: Heart (400×); F Lung (400×); G: Kidney (400×); H: Spleen (400×).

2.5 Western blot鑒定多克隆抗體的特異性

Western blot試驗結(jié)果顯示，以兔多克隆抗體1:5000倍稀釋，在接毒FAdV-8b和FAdV-11的蛋白泳道中沒有出現(xiàn)約110 KD的特異性蛋白，在接毒FAdV-4的蛋白泳道中出現(xiàn)了約110 KD的特異性蛋白條帶（圖5），表明兔多克隆抗體能與FAdV-4的Hexon蛋白結(jié)合，具有良好的特異性。

圖 5 Western blot鑒定兔多克隆抗體的特異性

Fig.5 Identification of rabbit polyclonal antibody specificity by Western blot

3 討論

腺病毒編碼的Hexon蛋白是病毒顆粒的主要衣殼蛋白之一，種屬之間的基因同源性很低。該蛋白不僅是病毒的主要保護性抗原，也是不同血清型之間存在差異且有決定性的蛋白[11,12]。鑒于Hexon蛋白在FAdV血清學(xué)診斷中常被作為包被的抗原及在基因疫苗開發(fā)中的應(yīng)用，故開展本研究。

目前，國內(nèi)很少關(guān)于FAdV-4型Hexon蛋白的原核表達及該蛋白特異性多克隆抗體制備的報道。 FAdV-4型毒株基因全序列為2814 bp，編碼937個氨基酸，包括四個高變環(huán)loop1、loop2、loop3和loop4和兩個非常保守的基座區(qū)P1和P2。根據(jù)多種血清型腺病毒Hexon蛋白的序列發(fā)現(xiàn)，塔底區(qū)多數(shù)是非常保守的，可變區(qū)也大多是位于loop1和loop2，因此這兩個區(qū)域是參與免疫反應(yīng)的主要抗原決定簇[13-15]。根據(jù)軟件預(yù)測免疫原性較好的一段蛋白位于loop1和loop2內(nèi)，分子質(zhì)量大小約為43 kDa。從SDS-PAGE檢測結(jié)果可知，該蛋白能在大腸桿菌內(nèi)表達，經(jīng)IPTG 37 ℃誘導(dǎo)表達3 h主要以包涵體的形式存在，為后續(xù)大量制備亞單位疫苗和建立ELISA血清學(xué)檢測提供了材料。

間接免疫熒光結(jié)果顯示，該多克隆抗體能與FAdV-4產(chǎn)生特異性熒光，與FAdV-8b和FAdV-11無特異性結(jié)合，具有良好的型特異性。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，中國目前流行的腺病毒主要為FAdV-4，因此制備的多克隆抗體能夠有效監(jiān)測FAdV-4的流行狀況，并且可用于FAdV-4臨床病例診斷及野毒的分離鑒定[16]。免疫組織化學(xué)顯示，針對Hexon蛋白的多克隆抗體可以與FAdV-4發(fā)生反應(yīng)，且特異性良好，可用于病毒定位與含量檢測，為該病致病機制的研究提供了技術(shù)手段。Western blot的方法進一步鑒定了該多克隆抗體的特異性，且敏感性好，為后續(xù)研究病毒與宿主蛋白相互作用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

針對Hexon蛋白的多克隆抗體能夠有效地檢測FAdV-4，且抗體效價及特異性較高，制備簡單、成本低廉，為該病的診斷、致病機制研究及亞單位疫苗的研制提供了技術(shù)保障。

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Preparation and Specificity Identification of Polyclonal Antibodies Against Fowl Adenovirus Hexon Protein

NIU Yu-juan1,2,3, SUN Qin-qin1,2,3*, ZHAO Jun1,2,3, SUN Wei4, ZHANG Hui-xia1,2,3, ZHANG Gui-hua1,2,3, XIAO Yi-hong1,2,3, SHANG Ying-li1,2,3, LIU Si-dang1,2,3**

1.271000,2.271000,3.271000,4.265603,

The purpose of this study is to prepare polyclonal antibodies against fowl adenovirus (FAdV) Hexon protein and to identify its specificity. The recombinant prokaryotic expression plasmid pET-28a-Hexon was constructed and transformed intoBL21 (DE3), IPTG induction, the recombinant protein was identified by SDS-PAGE, and the protein was purified. The polyclonal antibodies of Hexon protein was prepared by routine immunity in New Zealand white rabbits with purified fusion protein. The specificity of polyclonal antibodies was identified by indirect immunofluorescence, immunohistochemistry and Western blot. The results showed the prokaryotic expression of Hexon protein was high and existed in the form of inclusion body, and its molecular weight was about 43 kDa; Polyclonal antibodies having specific reaction with FAdV and high potency could be obtained in the immunized rabbits. The above results indicated the polyclonal antibody of FAdV Hexon protein prepared in this study proved to be of good specificity and provided a good material basis for the diagnosis, pathogenesis study and subunit vaccine development of avian adenovirus diseases.

Fowl adenovirus;gene; polyclonal antibody; specificity

S858;S852.4+3

A

1000-2324(2018)06-0928-05

10.3969/j.issn.1000-2324.2018.06.005

2017-10-27

2017-12-06

山東省“雙一流”獎補資金(2017)

牛玉娟(1989-),女,博士在讀,研究方向:專業(yè)基礎(chǔ)病理學(xué). E-mail:15215384671@163.com

*同等貢獻:孫芹芹(1991-),女,碩士在讀,研究方向:專業(yè)動物臨床病理學(xué). E-mail:18763809792@163.com

Author for correspondence. E-mail:liusid@sdau.edu.cn