細(xì)梗香草總皂苷聯(lián)合5-氟尿嘧啶抗膽管癌作用及其機(jī)制研究

汪洋 張?bào)泺P 汪靜 金杭斌 黃?，L 王雨承 楊建鋒

1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬杭州醫(yī)院 杭州 310006 2.杭州市老年病醫(yī)院

膽管癌是一種起源于上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，根據(jù)解剖部位可分為肝內(nèi)膽管癌和肝外膽管癌。膽管癌早期癥狀不典型，實(shí)驗(yàn)室常規(guī)及影像檢查也缺乏特異性，因此早期診斷困難。當(dāng)出現(xiàn)黃疸等癥狀時(shí)，往往已處于進(jìn)展期。大多數(shù)膽管癌都是腺癌，手術(shù)治療是其首選治療方式，但腫瘤易侵犯血管和淋巴結(jié)，手術(shù)切除范圍廣，并發(fā)癥多，手術(shù)總體效果并不佳，且多數(shù)膽管癌患者確診時(shí)已失去手術(shù)機(jī)會(huì)。對(duì)于無(wú)法手術(shù)的患者，全身化療是主要治療方案，然而膽管癌細(xì)胞具有高度促結(jié)締組織增生能力和異質(zhì)性，同時(shí)腫瘤微環(huán)境復(fù)雜，導(dǎo)致其化療效果不佳。由于膽管癌總體預(yù)后差，生存期短，因此對(duì)于進(jìn)展期膽管癌，研發(fā)新的藥物是改善患者預(yù)后的方向之一。

目前，尋找天然中草藥的有效成分是抗腫瘤藥物研究的方法之一。細(xì)梗香草性甘，味平，全草入藥，民間用于治療風(fēng)濕痹痛、月經(jīng)不調(diào)、咳喘，并有補(bǔ)虛、驅(qū)蛔之功效。體內(nèi)外研究證實(shí)細(xì)梗香草總皂苷（Lysimachia capilliposide，LC）對(duì)多種腫瘤有抑制作用[1-5]。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-Fu）在多種惡性腫瘤的治療中得到廣泛應(yīng)用，是消化系統(tǒng)腫瘤的常用化療藥，在結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌等惡性腫瘤的化療中都有運(yùn)用，臨床上多以聯(lián)合用藥為主，如聯(lián)合亞葉酸、奧沙利鉑和伊立替康可作為晚期結(jié)直腸癌的一線化療方案[6-7]。在臨床使用過(guò)程中，5-Fu可導(dǎo)致多種不良反應(yīng)，骨髓抑制是其中最常見(jiàn)的毒性反應(yīng)，其它諸如手足綜合征、口腔炎、神經(jīng)和心臟毒性等也時(shí)有發(fā)生，當(dāng)然這些不良反應(yīng)的發(fā)生和5-Fu的連續(xù)使用有關(guān)。另外一些與藥物劑型、劑量和持續(xù)輸注有關(guān)的副反應(yīng)包括惡心嘔吐、腹瀉、脫發(fā)和皮炎等。目前臨床上應(yīng)用以新一代的氟尿嘧啶藥物前體為主，療效更好，毒副反應(yīng)也更小[8]。

研究發(fā)現(xiàn)許多中藥與5-Fu聯(lián)合使用有增效、減毒的效果，也值得進(jìn)一步探究[9]。本文以人源膽管癌細(xì)胞株QBC939細(xì)胞為研究對(duì)象，研究LC單獨(dú)及與5-Fu聯(lián)用的抗膽管癌作用，并明確其作用機(jī)制，為膽管癌的中西醫(yī)結(jié)合治療尋找新的突破口；同時(shí)進(jìn)一步闡明LC的抗腫瘤作用機(jī)制，為L(zhǎng)C作為抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥物及細(xì)胞株 人膽管癌細(xì)胞株QBC939由杭州市第一人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心提供。5-Fu注射液為天津金耀藥業(yè)公司產(chǎn)品（批號(hào)：H12020959），劑量為0.25g:10mL。LC由浙江大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)系實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、Trypsin-EDTA（0.25%）胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素-鏈霉素均購(gòu)于 美國(guó) Gibco 公 司 （批 號(hào) ：11875093、25200056、10099141、15140122）；3-（4,5-二甲基吡啶-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑內(nèi)鹽[3-(4,5-diethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-etrazolium inner salt，MTS]細(xì)胞增殖試劑盒（比色法）購(gòu)于美國(guó)艾美捷科技有限公司（批號(hào)：K300-500）；Annexin Ⅴ/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)BD公司（批號(hào)：556547）；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)于杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：CCS012）；天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶-3（cysteine aspartic acid specific protease-3，caspase-3）抗體、多聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（poly-ADP-ribose polymerase，PARP）抗體均購(gòu)于美國(guó)CST公司（批號(hào)：9665T、9542T）。相應(yīng)二抗及β-actin內(nèi)參抗體均購(gòu)于美國(guó)Abbkine公司（批號(hào)：A21020、A01010）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) QBC939細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、飽和濕度。細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)，至70%～80%融合時(shí)以胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè) 前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示0.1～1 000μg·mL-1的 5-Fu作用 48h和 72h 對(duì)膽管癌細(xì)胞增殖有抑制作用；濃度為16～128μg·mL-1的LC作用24h、濃度2～32μg·mL-1的 LC作用48h及72h對(duì)膽管癌細(xì)胞增殖也有抑制作用。依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將消化傳代后的QBC939細(xì)胞以培養(yǎng)基重懸為單細(xì)胞懸液，以5×103個(gè)/孔的數(shù)量接種于96孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜后分別加入5-Fu和LC，使5-Fu終濃度分別為 0、0.1、1、10、100、1 000μg·mL-1，LC 終濃度分別為0、2、4、8、16、32μg·mL-1，繼續(xù)培養(yǎng) 48h。采用 MTS 法檢測(cè)，先加入培養(yǎng)基100μL/孔，再加入MTS試劑20μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)1h，用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm吸光度OD490。細(xì)胞存活率=（OD490實(shí)驗(yàn)孔-OD490空白孔）/（OD490對(duì)照孔-OD490空白孔）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，再以細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)，藥物濃度以10為底的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，用Graphpad Prism軟件繪制量效曲線，計(jì)算出兩藥各自的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration,IC50）。

1.2.3 藥物聯(lián)用實(shí)驗(yàn) QBC939細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的數(shù)量接種于96孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜后加入藥物，0、1、3、5、7μg·mL-1的 5-Fu 分別與 0、4、6、8、10μg·mL-1的LC進(jìn)行組合，5×5共有25種組合，各組均培養(yǎng)48h。采用MTS法檢測(cè)并計(jì)算各藥物濃度下細(xì)胞增殖抑制率，再計(jì)算藥物聯(lián)合作用指數(shù)(combined index，CI)判斷兩種藥物的協(xié)同性。CI=DA/ICX-A+DB/ICXB，其中A、B代表兩種不同藥物，ICX-A和ICX-B是兩種藥物單獨(dú)使用使細(xì)胞增殖抑制率達(dá)X時(shí)的藥物濃度，DA和DB是兩藥聯(lián)用使細(xì)胞增殖抑制率達(dá)X時(shí)兩種藥物的濃度。運(yùn)用Calcusyn 2.0軟件計(jì)算LC與5-Fu的CI值。當(dāng)CI值小于1時(shí)，提示兩藥聯(lián)用有協(xié)同作用，且數(shù)值越小，協(xié)同作用越強(qiáng)；CI值等于1時(shí)，說(shuō)明兩藥聯(lián)用有疊加作用；大于1時(shí)，說(shuō)明兩藥聯(lián)用有拮抗作用[9]。

1.2.4 細(xì)胞分組 根據(jù)CI及細(xì)胞增殖抑制率實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將細(xì)胞分為以下4組：（1）空白對(duì)照組：不加藥物干預(yù)；（2）5-Fu單藥組：僅使用 5-Fu單藥；（3）LC 單藥組：僅使用LC單藥；（4）聯(lián)合用藥組：聯(lián)合使用5-Fu和LC。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的QBC939細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔的數(shù)量接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后分為A、B、C、D組，加入不同濃度藥物，繼續(xù)培養(yǎng)48h后用不含EDTA的胰酶消化，800r/min、4℃離心5min后收集細(xì)胞。以預(yù)冷的PBS洗滌2次，800r/min、4℃離心5min。收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量約為 3×105，加入 1×Binding Buffer 100μL重懸細(xì)胞，再分別加入AnnexinⅤ-FITC 5μL和PI染液5μL，輕輕混勻。避光、室溫反應(yīng)15min后加入1×Binding Buffer 400μL，混勻后1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。另外再收集5×105細(xì)胞，PBS洗滌后加入DNA染液500μL和破膜劑10μL，渦旋振蕩5～10s混勻，室溫避光孵育30min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

圖1 5-Fu對(duì)QBC939細(xì)胞的增殖抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of 5-Fu on proliferation of QBC939 cells

1.2.6 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的QBC939細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔數(shù)量接種于6孔板中，分組同前，培養(yǎng)24h后加入不同濃度藥物，繼續(xù)培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞提取總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度，制備10%SDS-PAGE凝膠，每孔加入10μg樣品進(jìn)行電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉液封閉1h，分別加入相應(yīng)一抗（1:1 000稀釋），4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1:5 000稀釋），室溫孵育2h，應(yīng)用ECL化學(xué)發(fā)光顯色。Image J軟件進(jìn)行條帶灰度半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，兩組均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度5-Fu和LC對(duì)QBC939細(xì)胞的增殖抑制作用比較 0.1～1 000μg·mL-1的 5-Fu 和 2～32μg·mL-1的LC對(duì)QBC939細(xì)胞的增殖均有抑制作用，且呈濃度依賴性。見(jiàn)圖1-2。5-Fu和LC的IC50分別為3.22μg·mL-1、7.41μg·mL-1。

2.2 藥物聯(lián)用實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞分組 各濃度5-Fu與LC聯(lián)用CI值均小于1，表明這兩種藥物聯(lián)用具有協(xié)同作用。見(jiàn)表1。各濃度5-Fu與LC聯(lián)用的細(xì)胞存活率見(jiàn)表2。將表1與表2結(jié)果結(jié)合，選取5-Fu濃度3μg·mL-1、LC 濃度 4μg·mL-1進(jìn)行后續(xù)研究，故細(xì)胞分組為：空白對(duì)照組、5-Fu 單藥組（3μg·mL-1）、LC 單藥組（4μg·mL-1）和聯(lián)合用藥組（5-Fu 3μg·mL-1聯(lián)合LC 4μg·mL-1）。

圖2 LC對(duì)QBC939細(xì)胞的增殖抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of LC on proliferation of QBC939 cells

表1 各濃度5-Fu與LC聯(lián)合用藥的CI值（μg·mL-1）Tab.1 CI value of each concentration of 5-Fu combined with LC(μg·mL-1)

表2 各濃度5-Fu與LC聯(lián)合用藥的細(xì)胞存活率（%）Tab.2 Cell viability of each concentration of 5-Fu combined with LC(%)

2.3 各組細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期比較 藥物分別干預(yù)48h后，兩個(gè)單藥組和聯(lián)合用藥組的早期凋亡率和總凋亡率均高于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；LC單藥組的晚期凋亡率也高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。聯(lián)合用藥組早期凋亡率及總凋亡率明顯高于兩個(gè)單藥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表3、圖3。與空白對(duì)照組比較，5-Fu單藥組和聯(lián)合用藥組G1期細(xì)胞比例增多，G2期細(xì)胞比例減少（P＜0.05）；而 LC 單藥組 G1、G2期細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組S期細(xì)胞比例差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4、圖4。

2.4 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 Western blot提示，與空白對(duì)照組比較，其余3組caspase-3表達(dá)增高，PARP表達(dá)均減低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥組PARP表達(dá)均低于兩個(gè)單藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表5、圖5。

表3 各組細(xì)胞凋亡率比較（%）Tab.3 Comparison of apoptosis rates in each group（%）

表4 各組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布（%）Tab.4 Cell cycle distribution in each group（%）

圖3 各組細(xì)胞的凋亡流式分析Fig.3 Flow cytometry analysis on cell apoptosis in each group

圖4 流式細(xì)胞術(shù)分析各組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布Fig.4 Flow cytometry analysis on cell cycle in each group

圖5 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.5 Western blot analysis of apoptosis-related protein expression in each group

表5 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量Tab.5 Relative expression of apoptosis-related proteins in each group

3 討論

膽管癌發(fā)病率居肝膽惡性腫瘤的第2位，僅次于肝細(xì)胞癌，約占消化系統(tǒng)腫瘤的3%[10]。目前認(rèn)為慢性炎癥及膽汁淤積的存在是膽管癌發(fā)病的高危因素，包括原發(fā)性硬化性膽管炎、肝吸蟲(chóng)感染、肝內(nèi)膽管結(jié)石、膽管囊腫、肝炎病毒感染等[11-12]。膽管癌的治療首選手術(shù)切除，但由于早期診斷困難，僅30%患者可行治愈性切除，術(shù)后復(fù)發(fā)率達(dá)60%～80%[13]。對(duì)于無(wú)法手術(shù)切除而可以耐受化療患者，目前通常使用吉西他濱聯(lián)合順鉑的化療方案，但研究發(fā)現(xiàn)化療后患者的中位生存期也只有11.6個(gè)月[14]。因此，膽管癌總體預(yù)后差，生存期較短。

細(xì)梗香草為報(bào)春花科珍珠菜屬植物，主要分布于華南。LC占細(xì)梗香草總提取物含量的60%以上，其中又以皂苷B和C為主[15-16]。體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了LC對(duì)胃癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、胰腺癌均有抑制作用[1-5]，但LC對(duì)膽管癌的作用及內(nèi)在機(jī)制尚不明確。本文以LC單獨(dú)以及聯(lián)合5-Fu作用于膽管癌QBC939細(xì)胞，研究其對(duì)膽管癌增殖、凋亡的影響，并初步探索其中機(jī)制。

吉西他濱是膽管癌的一線化療藥物，前期研究以吉西他濱作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)吉西他濱單藥能夠抑制膽管癌細(xì)胞增殖，但與LC聯(lián)用時(shí)CI值均大于1，表明兩種藥物無(wú)協(xié)同作用。5-Fu也是膽管癌常用的化療藥物，預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)5-Fu與LC聯(lián)合用藥具有協(xié)同作用，因此本研究將5-Fu作為陽(yáng)性對(duì)照。3μg·mL-1的 5-Fu 與 4μg·mL-1的 LC 聯(lián)合作用于膽管癌細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率可達(dá)65.3%，CI值為0.638，且兩藥濃度均小于各自IC50，說(shuō)明LC可加強(qiáng)5-Fu對(duì)膽管癌的化療效果。

細(xì)胞周期中存在檢驗(yàn)點(diǎn)，當(dāng)DNA合成或復(fù)制存在差錯(cuò)時(shí)，細(xì)胞周期會(huì)發(fā)生阻滯，以進(jìn)行修復(fù)。當(dāng)細(xì)胞遺傳物質(zhì)損傷超過(guò)細(xì)胞修復(fù)能力時(shí)則會(huì)引發(fā)細(xì)胞凋亡，但是細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制存在較大差別，所以細(xì)胞周期阻滯與細(xì)胞凋亡的發(fā)生并非完全同步。本實(shí)驗(yàn)中，LC單藥使用及與5-Fu聯(lián)用均使凋亡細(xì)胞比例明顯增加，但與5-Fu不同，LC對(duì)細(xì)胞周期無(wú)明顯影響，說(shuō)明LC可能是通過(guò)其他通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而不改變細(xì)胞周期進(jìn)程。

多數(shù)中草藥的抗腫瘤作用是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)[17]，具體包括上調(diào)caspases-3，-8，-9和p53/p21的表達(dá)，增加Bax/Bcl-2比值，抑制PARP-1的表達(dá)等[17-18]。caspase-3作為細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，在兩種細(xì)胞凋亡途徑中均發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)證明LC可促進(jìn)caspase-3的表達(dá)，盡管聯(lián)合用藥組caspase-3表達(dá)量與單藥組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是聯(lián)合用藥組caspase-3表達(dá)量均高于任一單藥組。PARP是一種DNA修復(fù)分子，可以被caspase-3剪切為89kD和24kD兩個(gè)剪切體，其中89kD剪切體在經(jīng)中草藥干預(yù)的腫瘤細(xì)胞中普遍上調(diào)[18]。本研究過(guò)程中也曾觀察到這一現(xiàn)象，但由于觀察到的次數(shù)較少，未進(jìn)行半定量研究。目前認(rèn)為抑制PARP表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤放化療的療效，在本研究中也得到證實(shí)，因此PARP抑制劑也是抗腫瘤藥物研究方向之一[18-19]。

綜上所述，本研究證實(shí)LC與5-Fu具有協(xié)同作用，在體外可抑制膽管癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)控caspase-3和PARP表達(dá)有關(guān)。本研究的結(jié)果為L(zhǎng)C臨床用于膽管癌治療以及LC的抗膽管癌分子機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，后續(xù)研究中將進(jìn)一步繼續(xù)深入研究基因水平的調(diào)控機(jī)制。