基因工程在植物抗寒性研究中的應(yīng)用

譚 克 趙福順 姜奇峰 張 倩 金玉忠 王宇微

（吉林省蔬菜花卉科學(xué)研究院 吉林·長春 130033）

植物的低溫危害包括冷害和凍害。植物組織在冰點以上所受到的低溫傷害稱之為冷害（chilling injury）[1]。冷害是低溫對機體的生理損傷。除低溫外，對植物體的損傷程度取決于低溫維持時間的長短。所以，選育抗寒品種是抵御低溫危害的有效途徑，提高耐寒性也成為目前保護地栽培品種選育的研究重點。隨著生物技術(shù)在作物育種領(lǐng)域的應(yīng)用，借助基因工程來獲得抗寒種質(zhì)資源已成為重要的育種途徑。本文利用現(xiàn)有文獻資料，對國內(nèi)外植物抗寒基因工程研究進展做一番簡要的綜述。

1 植物冷誘導(dǎo)基因及其轉(zhuǎn)錄因子

植物冷誘導(dǎo)基因（cor）是一種誘導(dǎo)基因，COR基因僅在某些條件(例如低溫、短日等)下被激活以產(chǎn)生冷調(diào)節(jié)蛋白。從而提高了植物的耐冷性。1970年Weiser提出低溫鍛煉可引起基因表達的改變[2]。后來發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)植物在低溫鍛煉過程中都含有調(diào)寒物質(zhì)。當(dāng)分析相應(yīng)蛋白的物理和化學(xué)性質(zhì)時，發(fā)現(xiàn)它們與植物的抗寒性密切相關(guān)，從而這些蛋白被稱為冷調(diào)節(jié)蛋白（cold regulated proteins，CORPs） 和 冷 馴 化 蛋 白 （cold acclimation proteins，CAIPs)。為了實現(xiàn)概念上的統(tǒng)一，馬建忠將該類型基因統(tǒng)稱為冷誘導(dǎo)基因[3]。這些基因的共同特點是在零度以上低溫誘導(dǎo)表達，然后在常溫下停止或減少表達。目前從諸如擬南芥、油菜、第一雜交、菠菜、馬鈴薯、大麥、小麥、黑麥、胡蘿卜、水稻和番茄這樣的喜冷或冬季作物中獲得了近100個冷誘導(dǎo)的基因[4-5]。在眾多的冷誘導(dǎo)基因中，擬南芥冷調(diào)控基因COR15a的功能是研究較多的，它在擬南芥的抗寒性中起著重要作用。COR15a基因的過表達可使擬南芥的冷凍溫度降低1℃，提高擬南芥原生質(zhì)體的抗寒性。切斷信號肽后的COR15a成熟蛋白可直接作為一種保護蛋白，防止葉綠體的脂質(zhì)雙尾膜形成無序的不定結(jié)構(gòu)，提高葉綠體的抗寒性，維持其低溫下的光合能力，同時提高質(zhì)膜和其他內(nèi)膜的冷穩(wěn)定性[6]。Artus等研究表明，COR15a的表達增加了細胞膜的穩(wěn)定性，植株葉綠體耐低溫能力較對照提高1～2℃。

轉(zhuǎn)錄因子也稱反式作用因子，CBF（C-repeat binding factor）轉(zhuǎn)錄因子是一個基因家族，其包括CBF1、CBF2、CBF3、CBF4、CBF5和CBF6基因，它們在植物低溫信號通路[7-8]中起著重要作用。通過與下游調(diào)控基因啟動子DRE順式作用元件結(jié)合，介導(dǎo)上述逆境信號在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，在誘發(fā)植株對低溫、鹽分和干旱的響應(yīng)中具有重要作用[9]。CBF1和CBF3直接調(diào)節(jié)它們的下游靶基因，也可通過CBF2將信號向下游傳遞。

在低溫馴化過程中，CBF基因的表達是在低溫條件下快速誘導(dǎo)表達的[10]。通常在遭受低溫后15min內(nèi)CBF的表達即被啟動[11]。金萬梅等。以根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法將擬南芥冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活基因CBF1導(dǎo)入草莓中，通過PCR鑒定和Southern雜交，證明提高了草莓對低溫脅迫的抗性[12]。譚克等從抗冷性強的黃瓜葉片RNA中擴增并克隆了冷誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄因子CBF1，將其與CaMV 35S啟動子和Nos終止子融合后構(gòu)建植物表達載體，利用花粉管通道法將其轉(zhuǎn)入黃瓜，獲得了具有一定耐寒能力的黃瓜再生植株，總轉(zhuǎn)化率達到3.75‰[13]。孟平紅等構(gòu)建了含有冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子CBF 3的植物表達載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)入茄子，初步建立了抗寒茄子的再生轉(zhuǎn)化體系[14]。Hsieh等將擬南芥CBF1基因?qū)敕押蟀l(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株葉片過氧化氫酶活性顯著高于對照，過氧化氫含量顯著低于對照，番茄抗寒性得到改善[15]。Haake等人構(gòu)建植物表達載體將CBF4基因轉(zhuǎn)移到擬南芥中。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因作物的抗寒性和抗旱性都得到了提高[16]。劉榮梅等采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將CBF3基因?qū)霟煵葜?，獲得了Southern陽性轉(zhuǎn)基因煙草，通過對幼苗生理生化指標(biāo)的測定，表明轉(zhuǎn)基因煙草在低溫脅迫下的抗寒性強于對照[17]。

2 抗氧化酶活性基因

在低溫脅迫過程中，氧的利用能力降低，過量氧在代謝過程中轉(zhuǎn)化為活性氧（ROS），而活性氧對植物有毒害作用。這種活性氧在包括電子轉(zhuǎn)移的生化過程中是正常代謝物，但必須及時去除以維持低水平的動態(tài)平衡，否則，會引起膜脂過氧化、DNA損傷和蛋白質(zhì)變性，以及膜脂肪酸不飽和的減少，導(dǎo)致細胞損傷或死亡。在植物中，有一個完美的抗氧化防御系統(tǒng)，它具有清除活性氧的能力，其主要有酶促和非酶促兩類。酶促防御系統(tǒng)主要包含超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽還原酶（GR）等；非酶促防御系統(tǒng)包括谷胱甘肽（GSH）、維生素E、抗壞血酸（ASA）、胡蘿卜素等抗氧化物質(zhì)。而SOD是清除ROS的第一個重要的抗氧化酶，起著關(guān)鍵作用。目前研究表明高等植物中有三種SOD酶：線粒體Mn-SOD、葉綠體Fe、Cu/Zn-SOD和細胞質(zhì)Cu/Zn-SOD。McKersie等人從煙草中克隆了Mn-SOD的cDNA，并構(gòu)建植物表達載體轉(zhuǎn)入苜蓿的線粒體和葉綠體中，提高了植物中SOD的含量和活性，通過抗冷性實驗發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因苜蓿的越冬存活率獲得了較大提高，對除草劑二苯乙醚的抗性也顯著增強[18]。Gupta等從豌豆中克隆了Cu/Zn-SOD基因，并將其轉(zhuǎn)入煙草，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株葉綠體中SOD基因過量表達，抗壞血酸過氧化物酶（APX）含量增加，轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性得到顯著增強[19]。Ohkawa等用基因槍法將APX基因?qū)朦S瓜，經(jīng)GUS檢測證明其基因已成功轉(zhuǎn)入，與對照相比，轉(zhuǎn)基因植物的抗寒性顯著增強[20]。

3 抗凍蛋白基因

抗凍蛋白（anti freeze protein，AFP）是一種能增強抗凍能力的蛋白質(zhì)類的總稱。其能以非線性形式使水溶液的冰點降低，從而幫助有機體抵御冰凍環(huán)境?？箖龅鞍资?0世紀(jì)60年代從南北極動物血清中發(fā)現(xiàn)的，當(dāng)?shù)蜏貙?dǎo)致結(jié)晶形成時，AFP即會活化，其能特異地吸附于冰晶表面，抑制冰晶的重晶化，阻止晶格的形成,以及阻止小的冰晶結(jié)成更大的冰晶，從而減輕冰晶在凍融的動態(tài)變化中對生物體造成傷害。而一旦溫度升高，AFP就會完全喪失它的活性。

抗凍蛋白在魚類和昆蟲中的研究開始比較早，1991年，Hightower等將北極魚類的抗凍蛋白基因?qū)霟煵莺头阎?，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因作物的抗寒性增強[21]。黃永芬等通過花粉管通道法將美洲擬鰈的抗凍蛋白基因?qū)敕?，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株的生長勢優(yōu)于對照，致死溫度比對照組低2℃[22]。梁娜等利用內(nèi)生菌回接的方法將擬步甲昆蟲小胸鱉甲的抗凍蛋白MpAFP基因轉(zhuǎn)入棉花，其獲得的轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性高于對照，且隨著低溫處理時間的延長，抗凍蛋白的保護作用逐漸降低[23]。與動物抗凍蛋白研究相比，植物抗凍蛋白研究起步較晚。1992年，Griffith等人在加拿大首次發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)源AFP，標(biāo)志著植物抗凍蛋白研究的開始，隨后陸續(xù)從多種植物中獲得了具有熱滯效應(yīng)的AFP[24]。1994年費云標(biāo)等人從常綠抗凍植物沙冬青葉片中分離出了抗凍蛋白[25]。Wallis等將植物凝集素基因和AFP基因一起構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體，并將其轉(zhuǎn)入馬鈴薯。結(jié)果表明，在-2℃低溫條件下，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯葉片的電解質(zhì)滲透率比對照低2倍以上[26]。Huang等將樹狀抗凍基因DAFP21轉(zhuǎn)入擬南芥，轉(zhuǎn)基因植株的抗凍性比對照提高最多達3.3℃[27]。Worrall等人從一種低溫誘導(dǎo)的胡蘿卜中提取并克隆了AFP蛋白，并將其導(dǎo)入煙草中，轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性明顯高于對照，所獲得的轉(zhuǎn)基因煙草提取物能抑制冰晶的生長[28]。陳佳佳利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將矮沙冬青抗凍蛋白基因AnAFP轉(zhuǎn)入玉米未成熟幼胚中，結(jié)果表明，抗凍蛋白基因在玉米中異源表達，顯著提升了玉米的抗寒能力[29]。

4 滲透調(diào)節(jié)基因

當(dāng)植物遭受低溫、干旱和其他脅迫時，體內(nèi)將產(chǎn)生一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來防止失水和維持體內(nèi)的水平衡。這些物質(zhì)包括可溶性糖、脯氨酸、甜菜堿和游離氨基酸。在低溫脅迫條件下，植物通過促進滲透壓調(diào)節(jié)物合成酶的表達，增加體內(nèi)這些物質(zhì)的積累，從而調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的水平衡，避免低溫傷害。任曉平等測定了低溫脅迫下番茄幼苗葉片游離脯氨酸含量和脯氨酸脫氫酶活性。結(jié)果表明，耐冷品種o-33-1脯氨酸積累量增加，而感冷品種游離脯氨酸積累量減少，說明脯氨酸積累量在一定程度上反映了番茄的抗寒性[30]。Pilon-Smits等從細菌中克隆到膽堿氧化酶COX基因，分別轉(zhuǎn)入擬南芥、油菜和煙草中，提高了轉(zhuǎn)化植株中的甜菜堿含量和植株苗期低溫耐受性[31]。王關(guān)林等從枯草芽孢桿菌中分離克隆出果聚糖合酶（levansucrase）基因sacB，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入番茄植株，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株具備了良好的抗寒性[32]。

5 膜穩(wěn)定性基因

1973年，根據(jù)細胞膜結(jié)構(gòu)和功能與抗寒性的關(guān)系，Lyons提出了著名的“膜質(zhì)相變冷害假說”。產(chǎn)生冷害的根本原因普遍認(rèn)為是細胞膜系統(tǒng)的受損，細胞膜系統(tǒng)是植物中第一個感受外界刺激的地方。且膜系統(tǒng)也是植物細胞與外界環(huán)境進行物質(zhì)交換的通道和許多生理生化反應(yīng)的場所，因此膜系統(tǒng)的健康完整對植株的正常生長發(fā)育非常重要。研究表明，低溫冷害與生物膜系統(tǒng)類脂分子的相變密切相關(guān)[33]，細胞膜中不飽和脂肪酸的含量會影響相變溫度。近年來的研究進一步證明，脂肪酸去飽和代謝關(guān)鍵酶基因的引入可以提高植物的抗寒性。Kodama等人將脂肪酸去飽和酶基因Fad 7導(dǎo)入煙草并過量表達，植物中不飽和脂肪酸含量增加，抗寒性相應(yīng)提高[34]。于愛群等通過對高山被孢霉脂肪酸脫氫酶基因的研究表明，低溫可激活脂肪酸脫氫酶基因的轉(zhuǎn)錄，而脂肪酸脫氫酶是不飽和脂肪酸的關(guān)鍵合成酶[35]。Gombos等發(fā)現(xiàn)不飽和脂肪酸含量的降低可抑制植物的光合作用并降低其抗寒能力[36]。Ariizumi等人將Fad 7基因?qū)胨?，不僅提高了植株的抗寒性，而且提高了低溫下的光合速率和生長速率[37]。此外其它在擬南芥和菠菜中轉(zhuǎn)入脂肪酸去飽和酶的研究也證明增強了植株的抗寒性。

6 展望

參與植物抗寒的生理生化代謝過程非常復(fù)雜，目前國內(nèi)外在低溫逆境生理、低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究方面取得的一系列重要進展，克隆了與植物抗寒相關(guān)的一些基因，初步描述了植物低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的原理圖，為選育耐低溫品種以及在栽培上尋找對抗低溫的措施提供了科學(xué)依據(jù)，然而，由于植物抗寒基因工程屬于新的研究領(lǐng)域，還存在許多有待進一步研究的問題：①由于植物的抗寒性是多基因控制的特點，前期的研究主要集中在單一基因上，轉(zhuǎn)化植物的抗寒性受到限制。今后應(yīng)將重點放在多基因轉(zhuǎn)化，各基因之間相互作用，基因與各轉(zhuǎn)錄因子之間相互關(guān)系等更深入的領(lǐng)域。②研究植株的耐寒機理和篩選耐寒材料時，必須進行抗寒性鑒定，而所采用的鑒定指標(biāo)的準(zhǔn)確性及合理性是對育種材料抗寒性進行正確評價的關(guān)鍵。目前轉(zhuǎn)基因作物還未設(shè)立專用的鑒定方法，大多數(shù)都是沿用非轉(zhuǎn)基因作物的抗寒性評價方法，今后應(yīng)有針對性地建立轉(zhuǎn)基因作物抗寒評價方法。③在抗寒分子育種研究過程中，除了繼續(xù)尋找新的抗寒基因和途徑外，還可以嘗試對轉(zhuǎn)基因植株采用常規(guī)雜交手段進行性狀篩選與改良，通過基因工程技術(shù)與傳統(tǒng)育種手段相結(jié)合創(chuàng)造出抗寒性強的作物新品種。綜上所述，利用基因工程技術(shù)提高植物抗寒性的研究具有廣闊的發(fā)展前景。