甜菊糖生物合成相關(guān)基因的研究進(jìn)展

倪洪濤，董花，周艷麗

（1.黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱150080；2.甘肅省武威市涼州區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督管理站，武威733000）

0 引言

甜菊糖以天然無毒、零卡路里等特性受到世界消費者的青睞[1]，國內(nèi)外對甜葉菊生產(chǎn)發(fā)展非常重視，掀起了研究熱潮[2-6]。甜葉菊的生長發(fā)育，甜菊糖（Steviol glycosides，SGs）的生物合成、代謝、運輸?shù)然顒泳谢虻膮⑴c、調(diào)節(jié)和控制。商用的蛇菊苷（Stevioside，STV）和萊鮑迪苷A（Rebaudioside A，Reb A），是經(jīng)甲基赤蘚糖醇（MEP）途徑，由最初的物質(zhì)丙酮酸和甘油醛-3-磷酸在各種酶的催化作用下，一步步先合成牻牛兒牻牛兒焦磷酸（GGPP），此之前稱為早期階段；然后GGPP在4種酶基因：SrCPPS、SrKS、SrKO和SrKAH作用下轉(zhuǎn)化為甜菊醇（Steviol），之后在3個UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶（UGTs）基因SrUGT85C2、SrUGT74G1和SrUGT76G1的作用下形成STV和Reb A，整個過程共有15個酶基因參與；GGPP之后稱為晚期階段[7-9]。甜菊醇第一個糖基化（單一糖基化）是由SrUGT85C2作用在13位上羥基產(chǎn)生甜菊醇單糖苷，甜菊醇單糖苷進(jìn)一步在13葡萄糖2位位置糖基化產(chǎn)生甜菊醇雙糖苷，在SrUGT74G1作用下將19位羧基糖基化，產(chǎn)生甜菊醇三糖苷（STV）；STV在甜菊葉中含量最高，約是蔗糖甜度的250～300倍，STV進(jìn)一步經(jīng)SrUGT76G1糖基化產(chǎn)生甜菊醇四糖苷（Reb A），這被認(rèn)為是最甜的（是蔗糖甜度的350～450倍）、味道品質(zhì)好的糖苷[1]。GGPP作為幾個異戊二烯生物合成的中間物，因此分析和調(diào)控GGPP生物合成主導(dǎo)地位的基因，可能會控制植物二萜的合成。研究表明，晚期階段的SrCPPS、SrKS、SrKO、SrKAH，SrUGT85C2、SrUGT74G1和SrUGT76G1等酶基因在調(diào)控SGs含量具有非常重要的作用[7，9]。SGs的生物合成過程與赤霉素（GA）生物合成密切相關(guān)，甜葉菊葉片細(xì)胞內(nèi)GA合成過程中的一些酶含量及其活性都比較高，這將導(dǎo)致GA和甜菊糖的共同前體物質(zhì)貝殼杉烯酸的大量積累，為避免合成過量的GA，這些前體物質(zhì)在各種酶的作用下被轉(zhuǎn)化為甜菊醇，甜菊醇被糖基化形成甜菊糖（STV和Reb A等）[10]。因此搞清這些酶基因的作用機(jī)理，可有意地、更好地調(diào)控甜菊糖的生產(chǎn)量和品質(zhì)。本文主要綜述了甜菊糖生物合成途徑相關(guān)酶基因的研究進(jìn)展，為改善甜菊糖的生產(chǎn)提供參考。

1 參與甜菊糖生物合成途徑的酶基因

1.1 UGTs基因

1.1.1 基因的克隆、表達(dá)與分析

通過深入轉(zhuǎn)錄分析，為甜葉菊基因鑒定提供了契機(jī)。Chen等使用轉(zhuǎn)錄組測序給出了3個不同SGs組分的甜葉菊基因型轉(zhuǎn)錄譜的全貌，生成了191 590 282個高質(zhì)量測序，然后組裝成平均序列長度969堿基對的171 837個轉(zhuǎn)錄，總共有80 160個單一基因注釋，14 211個獨特的序列是由《京都百科全書》基因和基因組指定的特定的代謝途徑。對參與SGs合成的所有酶基因序列進(jìn)行了測定，總共143個UGTs基因被鑒定，其中的一些可能參與SGs的生物合成。RNA序列分析確定候選基因編碼的酶負(fù)責(zé)SGs的生物合成[11]。Totté等采用逆轉(zhuǎn)錄PCR，克隆了SrDXS和SrDXR的cDNA序列，測知分別含有2 148和1 422個核苷酸的開放閱讀框，其氨基酸序列包各含716和474個殘基，分別編碼76.6和51 kDa的多肽[12]。

馬凌波克隆得到了甜葉菊類黃酮UGTs基因，與其他同類UGTs基因的氨基酸序列相似性高達(dá)53%～70%，約45%的氨基酸序列完全一致。擴(kuò)增獲得甜葉菊UGTs基因UGT1和UGT2的全長分別為1568bp和1662bp，開放閱讀框分別為1 419 bp和1 362 bp，各編碼473個和454個氨基酸；二者共有44個氨基酸特征性的保守序列，與常見的UGTs基因的相似性分別達(dá)26%～46%和44%～74%。UGT1作為甜葉菊體內(nèi)的類黃酮UGT，具有廣泛的底物特異性，既參與類黃酮的糖基化，又能作用于甜菊醇，形成甜菊糖，當(dāng)形成大量的GA前體物質(zhì)、使甜葉菊的正常代謝受到威脅時，UGT1等基因就會起作用將其合成STV和Reb A等甜菊糖[10，13]。蘇樨州[14]、董振紅[15]、劉歡等[16]和杜婷[17]進(jìn)行了甜葉菊SrUGT76G1基因克隆到酵母中表達(dá)的研究。UGT在糖苷的合成中具有顯著優(yōu)勢，但其分離純化較難和所用底物昂貴的原因，致使糖苷酶促合成的成本高。尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）是最常見的糖基供體。蔗糖合成酶可催化蔗糖和UDP生成果糖和UDPG，該反應(yīng)與UGTs所催化的糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)偶聯(lián)，可有效地循環(huán)再生UDPG?？稍谔鹑~菊糖基轉(zhuǎn)移酶基因SrUGT76G1的作用下，以UDPG為糖基供體，特異性催化STV合成Reb A[17]。因此，杜婷采用兩步PCR的方法，合成擬南芥蔗糖合成酶AtSUS1的編碼基因，并將其亞克隆到攜帶SrUGT76G1基因的表達(dá)質(zhì)粒上，構(gòu)建了雙酶共表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。首次成功進(jìn)行了蔗糖合成酶基因的合成，初步建立循環(huán)利用UDPG的“一鍋雙酶”催化體系，比較添加UDPG和UDP的反應(yīng)體系，只需要添加相對廉價且遠(yuǎn)低于理論值用量的UDP為起始底物，大大降低了生產(chǎn)成本[17]。Yang等分析了約500樣品（雜交后代）葉子的STV和Reb A含量，發(fā)現(xiàn)一個突變株“Z05”的Reb A水平非常低，因為SrUGT76G1基因負(fù)責(zé)STV轉(zhuǎn)換為Reb A，所以通過測序候選基因SrUGT76G1來鑒定突變體。同時，發(fā)現(xiàn)一些氨基酸替換顯著改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，因此，無序突變和氨基酸替換突變導(dǎo)致Reb A水平非常低[18]。張虹等以6個甜葉菊品種為材料測定SrUGT76G1、SrUGT85C2和SrUGT91D2m三個關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量，結(jié)果顯示SrUGT76G1基因相對表達(dá)量與Reb A含量有極顯著相關(guān)關(guān)系，而SrUGT85C2和SrUGT91D2m基因表達(dá)量與Reb A含量無相關(guān)，說明SrUGT76G1基因的表達(dá)對Reb A合成有著較為重要的影響，有望利用基因工程手段人為調(diào)控甜菊糖的生物合成、提高RebA的含量[19]。郭書巧等進(jìn)行了甜葉菊SrUGT76G2基因克隆到酵母中表達(dá)的研究。從甜葉菊葉片中分離了分子量為52.029 kD由458個氨基酸殘基組成多肽的與甜葉菊SrUGT76G1高度同源的SrUGT76G2基因，與SrUGT76H1有35%的一致性，個別位置氨基酸存在差異；SrUGT76G2基因在甜葉菊不同組織中具有表達(dá)特異性，在葉中的表達(dá)豐度較高，在莖中表達(dá)較低，在根中不表達(dá)[20]。

Madhav對甜葉菊12個UGTs的3個UGTs-SrUGT76G1、SrUGT74G1和SrUGT85C2功能基因組學(xué)在STV合成進(jìn)行了研究。一個UGT基因命名SrUGT顯示與SrUGT76G1相似，SrUGT在成熟葉的表達(dá)水平相對較高。盡管與SrUGT76G1基因核苷酸有相似性，基因SrUGT在蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)有48個SNP和39個關(guān)聯(lián)氨基酸替換的顯著變化。在SrUGT觀察到一種新的氨基酸的存在呈螺旋狀變化，氨基酸、保守組氨酸和阿斯巴甜殘留氫鍵異常替換，支持甜葉菊其它UGTs功能的穩(wěn)定性和特異性?；谶@些特點，SrUGT表現(xiàn)了不同于甜葉菊其他UGTs的新情況[21]。甜葉菊中SGs生物合成途徑和GA的生物合成路徑為共同起源的不同分支，異貝殼杉烯酸（KA）做為分枝，MEP途徑的底物，也導(dǎo)致GA合成[17，21]。Guleria等研究農(nóng)桿菌介導(dǎo)瞬時基因沉默（AMTS）RNA干擾（RNAi）途徑。在甜葉菊SrKA13H和3個SrUGTs（SrUGT85C2、SrUGT74G1和SrUGT76G1）基因分別編碼KA和SGs生物合成途徑的3個UGTs基因沉默，來理解其分子機(jī)制及與GA的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)SrKA13H和3個SrUGTs基因的AMTS的RNAi顯著地降低內(nèi)源基因的表達(dá)及總SGs的積累；而赤霉素（GA3）含量顯著增強(qiáng)了SrUGT85C2和SrKA13H的AMTS。SrKA13H和SrUGT85C2的沉默阻止了SGs途徑的代謝通量而轉(zhuǎn)向GA3的生物合成。證實SrUGT76G1合成SGs的替代途徑底物的親和力最高，SrUGT76G1沉默使SGs含量降到最低。結(jié)論：SrKA13H和SrUGT85C2被確定為影響SGs和GA生物合成的碳通量調(diào)控基因[22]。用甜葉菊轉(zhuǎn)基因擬南芥SrUGT85C2基因過量表達(dá)來檢測對GA積累及植株生長參數(shù)的影響，轉(zhuǎn)基因株顯示GA3含量減少78%～83%，并表現(xiàn)GA缺陷表型，包括下胚軸長度發(fā)育不良，芽生長減少，相對含水量顯著下降，葉綠素a和葉綠素b含量分別減少17%～37%和64%～76%。減少光合色素可能顯著降低植物生物量，如SGs和GA的生物合成，在質(zhì)體MEP途徑，葉綠素生物合成前體也由IPP和DMAPP生成。在轉(zhuǎn)基因株MEP途徑酶的編碼基因SrGGDPS、SrCDPS、SrKAO、葉綠素合成酶和葉綠素a氧化酶基因下調(diào)表達(dá)，SrUGT85C2超表達(dá)可能降低GA和葉綠素含量[23]。甜葉菊的葉片由SrUGT74G1編碼的UGTs催化將甜菊雙糖苷轉(zhuǎn)化為STV。以轉(zhuǎn)擬南芥基因SrUGT74G1 cDNA的超表達(dá)來開發(fā)STV生物合成的可能性。然而，在轉(zhuǎn)基因株中STV積累不明顯。同時，轉(zhuǎn)基因擬南芥株在GA3含量的SrUGT74G1超表達(dá)沒有變化，而兒茶素卻顯著積累，轉(zhuǎn)基因株的芽長、根長和叢生面積均增加，自由基清除作用增加了；轉(zhuǎn)基因株種子產(chǎn)量也比對照增加6%～15%[24]。對甜葉菊微繁殖30 d進(jìn)行候選基因轉(zhuǎn)錄分析，結(jié)果，15個候選基因轉(zhuǎn)錄中，有9個上調(diào)兩倍以上，轉(zhuǎn)錄差異與STV含量（由0 d的11.48%增加到30 d的13.57%）顯著提高相關(guān)[25]。

1.1.2 外源調(diào)節(jié)物質(zhì)處理對基因的影響

研究表明，不同器官中SGs生物合成途徑的15個基因表達(dá)與SGs含量有關(guān)系，SGs積累量在葉組織最大，其次在莖稈和根，15個基因的表達(dá)模式亦如此。這些基因回應(yīng)并調(diào)節(jié)萜類的生物合成。GA3處理SrUGT74G1基因表達(dá)上調(diào)，而茉莉酮酸甲酯（MeJA）和激動素處理15個基因表達(dá)下調(diào)[8，26]。在可控溫室條件甜葉菊植株經(jīng)聚乙二醇（PEG）、GA和PBZ處理，GA和PBZ處理分別增加和減少了STV，Reb A、B、C、F，甜茶苷，甜菊雙糖苷，杜爾可苷A和總SGs含量。PBZ處理提高了Reb A/STV比，這意味著甜葉菊提取物的余味苦味降低了；GA處理沒有顯著影響這個比例。不同處理下Srent-KS1-1、Srent-KAH和SrUGT74G1的轉(zhuǎn)錄相當(dāng)穩(wěn)定，而PBZ和PEG處理下Srent-KO、SrUGT85C2和SrUGT76G1的轉(zhuǎn)錄顯著降低。PBZ和PEG處理對基因的轉(zhuǎn)錄均產(chǎn)生負(fù)面影響，而GA處理則相反[27-28]。Khan等將甜葉菊葉外植體經(jīng)一系列的EMS和γ輻射處理，所有處理中，甜菊糖的增加是由于SrUGT74G1和SrUGT76G1分別執(zhí)行STV和Reb A的生物合成。EMS處理植株的SrUGT74G1和SrUGT76G1基因表達(dá)增加5～6倍；而γ輻射處理植株的SrUGT76G1基因表達(dá)增加5倍[29]。通過應(yīng)用PEG（5%、10%和15%）模擬干旱脅迫研究了SGs的含量及其相關(guān)的6個基因轉(zhuǎn)錄水平。PEG處理使SrKS、SrKO、SrKAH和3個SrUGT85C2、SrUGT74G1和SrUGT76G1的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，顯著降低STV，Reb A、B、C和F，甜菊糖雙苷，甜茶苷和總SGs的含量。表明，SGs生物合成途徑中SGs含量與基因的轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)。因此，PEG誘導(dǎo)干旱脅迫對SGs含量和SGs生物合成基因轉(zhuǎn)錄有負(fù)面影響，建議：甜葉菊實施充分的灌溉以獲得高含量的SGs[30]。在干旱脅迫下SrUGT74G1、SrUGT76G1和SrUGT85C2基因參與STV到Reb A生物合成途徑的表達(dá)，SrUGT76G1基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于SrUGT74G1和SrUGT85C2基因，SrUGT76G1基因是由STV到Reb A合成途徑的主要基因[31]。

1.1.3 外部環(huán)境因素對基因的影響

外部環(huán)境因素如光、溫、水可影響植物生長和次生代謝。SGs生物合成途徑的15個基因的轉(zhuǎn)錄水平在15℃～25℃達(dá)最大，低于15℃和高于35℃下，SrUGT85C2和SrUGT76G1的轉(zhuǎn)錄受到抑制；在水脅迫下大多數(shù)基因表達(dá)下調(diào)。在生長階段SGs的含量有明顯的變化，在快速生長時期15個基因的轉(zhuǎn)錄水平是最小的，在現(xiàn)蕾階段和開花階段表現(xiàn)出明顯的增加。說明，環(huán)境因素對甜葉菊SGs含量和相應(yīng)的生物合成基因轉(zhuǎn)錄的影響是顯著的[32]。3個UGTs的候選基因SrUGT85C2、SrUGT74G1和SrUGT76G1的翻譯產(chǎn)物，對STV和Reb A的合成有活性，在3、6和9d灌溉間隔下（對應(yīng)土壤含水量分別為田間容量的90%、75%和60%）土壤含水量75%時導(dǎo)致SrUGT85C2和SrUGT74G1基因表達(dá)顯著增加，而在土壤含水量60%時SrUGT76G1基因表達(dá)顯著增加。在土壤含水量60%時SrUGT76G1的轉(zhuǎn)錄和Reb A積累顯著相關(guān)。在75%和60%土壤含水量，SrUGT74G1轉(zhuǎn)錄顯著高于S rUGT85C2和SrUGT76G1。這些結(jié)果表明，Reb A/STV比的最高值是土壤含水量60%、9d灌溉間隔，可通過這些基因的上調(diào)和下調(diào)來改善糖苷的產(chǎn)質(zhì)量[33]。

由基因轉(zhuǎn)錄分析紅LED燈對SGs合成的效果。植株生長在短日照（8 h；SD）、長日照（16 h；LD）或短日照在夜間用紅LED燈處理（SD+LED）。處理76 d后，SD組完全開花，其余各組仍處于生長狀態(tài)。植株發(fā)育后一些生物合成基因的轉(zhuǎn)錄降低，尤其是Srent-KS和SrUGT85C2基因，而其他的基因基本上保持不變。LD和SD+LED組或兩組之間幼苗植株個體發(fā)育很少或無顯著變化?；蜣D(zhuǎn)錄可能主要受個體發(fā)育的影響，其本身受光周期的影響。在這些條件下，紅LED燈影響基因的轉(zhuǎn)錄，間接影響營養(yǎng)生長。在紅LED燈LD下可延長營養(yǎng)生長甚至更長。轉(zhuǎn)錄水平為：S rUGT74G1＞SrUGT85C2＞Sr ent-KAH＞SrUGT76G1＞Srent-KS＞Srent-KO，基因轉(zhuǎn)錄與產(chǎn)物間無顯著相關(guān)，不同基因間的轉(zhuǎn)錄水平有顯著相關(guān)性[34]。在紅/遠(yuǎn)紅光（R/FR）1.22發(fā)光二極管（LED）和藍(lán)色LED處理下，參與催化糖轉(zhuǎn)移反應(yīng)的SrUGT85C2轉(zhuǎn)錄較高。表明，SGs相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平和SGs含量受光處理的影響而影響GA含量。該方法可作為光處理提高SGs含量的實用方法[35]。

在體內(nèi)外繁殖的植株不論是老的或年輕葉片STV和Reb A濃度都很高，在節(jié)點和節(jié)段SGs含量較低，但體外高于體內(nèi)繁殖株。SGs含量與參與SGs生物合成的SrUGT76G1和SrUGT74G1轉(zhuǎn)錄水平間存在顯著的相關(guān)關(guān)系，因此，在體外培養(yǎng)條件下不影響SGs的合成和積累能力[36]。

1.2 甜菊糖生物合成途徑的其它酶基因

1.2.1 基因在不同組織的表達(dá)

甜菊葉積累的混合物至少有8個不同來源的四環(huán)二萜甜菊醇，有與GA類似的生物合成起源。GA形成的初始步驟是：由SrCPS和SrKS催化GGDP到貝殼杉烯。已經(jīng)從甜葉菊分離出兩個SrCPS和SrKS基因，發(fā)現(xiàn)重組SrCPS和SrKS催化是活躍的，這表明SrCPS和SrKS基因參與甜菊醇的生物合成，編碼SrCPS和SrKS的基因通常存在于大多數(shù)植物的單個拷貝中，其表達(dá)是通常低且限于迅速生長的組織。SrKS基因已在甜葉菊基因組中復(fù)制，SrKS和SrCPS基因在成熟的葉片高表達(dá)，而GA生物合成模式卻相反[37]。甜葉菊葉片產(chǎn)生高濃度的二萜SGs，參與二萜合成的轉(zhuǎn)錄源很豐富。為了開發(fā)基因資源和增加對SGs生物合成的理解，從甜葉菊葉片cDNA文庫測序了5548個ESTs。ESTs一個顯著的部分是標(biāo)準(zhǔn)葉代謝途徑所特有的；能量代謝和初級代謝分別為總轉(zhuǎn)錄的17.6%和13.1%，二萜代謝占總轉(zhuǎn)錄的1.1%。鑒定了SGs途徑的70%候選基因，其中一個候選基因SrKO是ESTs集合中第八個最豐富的基因。鑒定的SrDXP途徑的許多特異候選基因表明，GGDP的前體異戊烯基焦磷酸是通過非甲羥戊酸途徑生成的。EST的使用大大促進(jìn)了候選基因的鑒定及增加了我們對二萜代謝的理解[38]。

郭書巧等利用RT-PCR方法從甜葉菊葉片中分離了與SGs生物合成密切相關(guān)的基因SrKA13H，該基因編碼分子量54.476 kD由476個氨基酸殘基組成的多肽，是典型的細(xì)胞色素P450基因，SrKA13H在甜葉菊根、莖、葉和花組織中呈組成型表達(dá)，葉和花中的表達(dá)豐度較高。推測SrKA13H可能在SGs生物合成過程中發(fā)揮重要作用[39]。Kumar等測定了 SrMCT、SrCMK、SrMDS、SrHDS、SrHDR、SrIDI和 SrGGDPS七個基因的全長cDNA序列，分別為1 241 bp、1 500 bp、870 bp、2 599 bp、1 629 bp、1 048 bp和1 245 bp，開放閱讀框分別為954 bp、1 215 bp、696 bp、2 223 bp、1 377 bp、699 bp和1 086 bp。與其他節(jié)段位置的葉子相比，第三個節(jié)段的位置葉子（頂端葉為第一葉）的SGs含量最高。除SrDXR和SrKO，在第一節(jié)段和第五節(jié)段葉中基因的表達(dá)最大和最??；SrKO在第三節(jié)段葉片表達(dá)最高，而SrDXR在第三節(jié)段葉片表達(dá)增加以后逐漸下降。GA3處理S rMCT、SrCMK、SrMDS基因表達(dá)上調(diào)[8]。低于 15℃和高于 35℃下，SrDXS、SrDXR、SrMCT、SrCMK、SrMDS、SrHDS、SrHDR、SrIDI、SrGGDPS、SrCPPS1、SrUGT85C2和SrUGT76G1的轉(zhuǎn)錄受到抑制[32]。甜葉菊產(chǎn)物不僅是雙萜類糖苷，還有其它的半日花烷型二萜（LDT）。分析表明在甜葉菊葉片細(xì)胞中SGs累積；在表皮毛中含有LDT，如氧代淚柏醚和貝殼杉醇酸。這些代謝物由轉(zhuǎn)錄組引導(dǎo)，明確了特定基因在MEP編碼酶和甜菊醇或其它LDT的生物合成。SrCPS2和SrKSL在表皮毛中表達(dá)；SrCPS和SrKS1體內(nèi)外植株的表達(dá)是不同的；SrCPS2與SrKSL聯(lián)合催化生成淚柏醚和上淚柏醚。表明，甜葉菊葉片組織進(jìn)化到使用不同的代謝途徑以避免代謝干擾來產(chǎn)生不同的次級代謝產(chǎn)物[40]。一般通過MEP途徑合成SGs、GA、色素和其他異戊二烯基次生代謝產(chǎn)物。為闡明甜菊醇的作用，進(jìn)行了甜菊糖前體引導(dǎo)植株葉組織STV生物合成的培養(yǎng)試驗，前體或誘導(dǎo)子負(fù)責(zé)刺激葉中STV的生產(chǎn)。對根和葉中參與STV生物合成基因轉(zhuǎn)錄分析，發(fā)現(xiàn)參與甜菊醇生產(chǎn)的關(guān)鍵酶SrKAH的轉(zhuǎn)錄在根和葉組織中相同。然而，當(dāng)這些植株以前體甜菊醇處理，在該途徑的多數(shù)基因表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)。有趣的是，需要很小濃度的前體來提高該途徑基因的轉(zhuǎn)錄水平[41]。

1.2.2 外部因素對基因表達(dá)的影響

將矮壯素添加于MS培養(yǎng)基（添加萘乙酸、激動素、噻苯?。?，測定了矮壯素對體外培養(yǎng)的形態(tài)發(fā)生、抗氧化劑活性、SrKA13H基因表達(dá)水平的影響。結(jié)果，矮壯素對離體形態(tài)有顯著作用，對葉子外植體胚性愈傷組織形成、愈傷組織和生根效率有促進(jìn)作用。矮壯素也促進(jìn)了甜葉菊葉片SrKA13H基因表達(dá)水平[42]。甜菊醇是STV和Reb A的脂溶性構(gòu)架，是葉綠體萜途徑經(jīng)SrKA13H調(diào)解由KA合成。MeJA（20μmol/L）體外處理誘導(dǎo)糖苷生物合成顯著，而高濃度MeJA（100μmol/L）導(dǎo)致糖苷的生產(chǎn)和增長降低，處理后3d，植株中糖苷含量最高。MeJA處理后6～48h也增強(qiáng)SrKA13H基因的表達(dá)[43]。在植物生長室和大田實驗表明SrMDS是一個光調(diào)控基因。吲哚乙酸（50、100μmol/L）處理4 h下SrMDS基因下調(diào)表達(dá)，而脫落酸無調(diào)節(jié)表達(dá)。在白天光照下SrMDS表現(xiàn)高表達(dá)（與黑暗時間相比）[44]。SGs的一部分合成是通過質(zhì)體MEP途徑進(jìn)行，其中HDR是關(guān)鍵酶。甜葉菊的SrHDR在遺傳互補(bǔ)成功救援HDR致死突變株MG1655，表明SrHDR編碼功能蛋白。該基因表現(xiàn)晝夜差異，SrHDR在光照下最大限度地表達(dá)，即在06：00時光照強(qiáng)度580μmol/(m2·h)和10：00時光照強(qiáng)度1 665 μmol/(m2·h)；在暗期（20：00時；探測不到光）無表達(dá)[45]。

Mandal等接種叢枝菌根真菌（AMF）比較了SGs生物合成途徑的11個主要基因的轉(zhuǎn)錄。結(jié)果，AMF植物的基因編碼MEP途徑酶，即SrDXS、SrDXR和SrMDS為負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控。提高AMF植物對鋅和錳的吸收會增強(qiáng)SrMDS的轉(zhuǎn)錄。AMF植株SrCPPS和SrKAH的轉(zhuǎn)錄表達(dá)增強(qiáng)，對SGs的生物合成起重要作用，SrCPPS調(diào)節(jié)代謝物質(zhì)合成KA前體，SrKAH引導(dǎo)這些甜菊醇代替GA合成。通過4個特定的UGTs指令使甜菊醇糖基化為Reb A，以SrUGT76G1轉(zhuǎn)錄水平最高，特別改善了Reb A/STV比，使甜味品質(zhì)增強(qiáng)[46-47]。Guleria等測定了擬南芥對甜葉菊SrKA13H cDNA的異位表達(dá)，與對照比，兩個擬南芥轉(zhuǎn)基因株系的SrKA13H基因超表達(dá)使甜菊醇含量（1～3μg/g DW）顯著增加；其內(nèi)源性生物活性調(diào)節(jié)物質(zhì)赤霉素均減少，表現(xiàn)為GA缺乏突變體的表型性狀；內(nèi)源GA含量減少會出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因侏儒癥，外源GA3可拯救轉(zhuǎn)基因侏儒癥。0.2～1.0μg/mL外源甜菊醇的應(yīng)用不影響花粉萌發(fā)。在擬南芥轉(zhuǎn)基因植株中甜菊醇的形成沒有變化，種子產(chǎn)量卻降低24%～48%[48]。

1.2.3 miRNA調(diào)節(jié)生物合成途徑的基因

miRNAs作為基因表達(dá)的調(diào)節(jié)器，在調(diào)節(jié)SGs生物合成途徑的基因網(wǎng)絡(luò)起重要作用，測定表明所有的miRNAs在甜葉菊葉、莖和花3個組織的表達(dá)不同，其表達(dá)水平與SGs含量有一定關(guān)系。分別有8、6、4、3和1個miRNA以生物合成途徑中的SrUGT85C2、SrKO、SrKAH、SrKS和SrUGT76G1作靶標(biāo)基因，SrUGT85C2是miR319a、miR319b、miR319c、miR319d、miR319e、miR319f、miR319g和miR319h的靶標(biāo)基因，其中，除miR319h外7個miRNA均顯示多位點的相互作用；SrKO是miR319a、miR319c、miR319f、miR319g、miR319h和miRstv_9的靶標(biāo)基因；SrKAH是miR319a、miRstv_7、miRstv_9和miRstv_11的靶標(biāo)基因；SrKS是miR319b,miR319d,miR319g靶標(biāo)基因；SrUGT76G1是miRstv_7的靶標(biāo)基因。掌握這些遺傳調(diào)控，可能協(xié)助選擇和操縱得到高效植物基因型[47，49]。

2 其它途徑的基因

在生物細(xì)胞內(nèi)，鈣調(diào)蛋白（CaM）與鈣離子結(jié)合激活一些靶酶和非酶蛋白質(zhì)，與靶酶相互作用調(diào)控生物體的生長發(fā)育及對外界脅迫的反應(yīng)和適應(yīng)能力。熊玲媛等克隆甜葉菊SrCaM基因得到了兩個異型基因，二者均由450個核苷酸組成，編碼148個氨基酸，85%的核苷酸序列同源，99%的氨基酸序列同源，其差異是僅在第122個氨基酸由丙氨酸代替了纈氨酸。初步分析表明SrCaM是進(jìn)化過程中極保守的蛋白，在生物的代謝和生長發(fā)育過程中是必不可少的。甜葉菊SrCaM基因在大腸桿菌中得到表達(dá)。為了能在植物中表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP），通過PCR擴(kuò)增將改良的GFP基因GFP-mutZ連入到中間載體，構(gòu)建了帶有GFP-mutZ的植物雙元表達(dá)載體，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)下對甜葉菊愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化，用潮霉素（HYG）作為抗性篩選劑進(jìn)行篩選，檢測顯示，雙元載體上GUS基因在甜葉菊細(xì)胞中已得到表達(dá)，外源GFP基因己整合到甜葉菊愈傷組織的基因組中，在轉(zhuǎn)基因甜葉菊愈傷組織中己獲得了表達(dá)[50-51]。

3 展望

未來的甜菊糖研發(fā)方向：⑴創(chuàng)造預(yù)期的條件，有意增強(qiáng)或降低某種酶基因的濃度，使之向著需要的糖苷方向生產(chǎn)；⑵建立廉價有效循環(huán)再生的糖基供體的多酶催化體系，降低原料生產(chǎn)成本；⑶Reb A甜度雖高，但高濃度回味仍具苦味，Reb C只是葡萄糖甜度的30倍，含量低的五糖苷Reb D和六糖苷Reb M及其共混物甜度高達(dá)蔗糖的350倍，并極大降低了苦味[52]。在測試中Reb D是最甜的，明顯比Reb B苦味低；與Reb A等相比，Reb M是具高甜度、快速和干凈的味道，大大降低了甘草、苦、酸苦澀的回味。這些特性使Reb D和Reb M成為優(yōu)質(zhì)的高潛力的天然甜味劑。Reb D和Reb M只存在于甜葉菊葉且含量極低（0.4%～0.5%），從甜葉菊中提取是不切實際和昂貴的。編碼的SGs包括Reb D和Reb M生物合成的基因已被鑒定，SGs的途徑已在酵母中成功表達(dá)，微生物提供了Reb D和Reb M的異源生產(chǎn)替代[53]。因此，有望借助微生物實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)下一代甜葉菊甜味劑，有能力控制不同的基因表達(dá)并能修飾酶的底物特異性。