發(fā)作性睡病1型的免疫學(xué)研究進展

徐 濤， 吳惠涓， 趙忠新

發(fā)作性睡病是一類以日間過度思睡、猝倒發(fā)作和夜間睡眠障礙為主要特征的慢性睡眠障礙，可伴有體重增加，入睡前幻覺和心理障礙等臨床表現(xiàn)[1]。根據(jù)國際睡眠障礙第三版(ICSD-3)的分類，發(fā)作性睡病被分為兩型[1]：1型，伴猝倒發(fā)作，患者腦脊液中下丘腦分泌素-1(Hypocretin-1，Hcrt-1)水平有明顯下降；2型，不伴猝倒發(fā)作，腦脊液中Hcrt-1水平無明顯下降。人類外側(cè)下丘腦有大約70000個生產(chǎn)Hcrt-1的神經(jīng)元，此類神經(jīng)元在1型發(fā)作性睡病患者腦內(nèi)有90%～95%已缺失[2]。研究顯示，Hcrt-1是腦內(nèi)重要的維持覺醒的遞質(zhì)，其缺失是導(dǎo)致1型發(fā)作性睡病的主要病理因素[3]。因此，探究下丘腦Hypocretin能神經(jīng)元損傷或凋亡的機制是明確發(fā)作性睡病病因的關(guān)鍵。

發(fā)作性睡病以散發(fā)病例為主，家族聚集性低[4]。據(jù)統(tǒng)計，患者一級親屬的發(fā)病風(fēng)險雖是正常人群的20～40倍，但發(fā)病率僅為1%～2%；即使同卵雙胞胎的共患率也只有25%～30%。這些證據(jù)表明，發(fā)作性睡病的遺傳并非決定因素，后天獲得性的影響更為重要。長期以來，自身免疫因素被認為是特異性Hypocretin能神經(jīng)元損傷的主要原因[5]，基于此類學(xué)說，我們從基因多態(tài)性、感染與疫苗、體液免疫、細胞免疫以及應(yīng)激損傷五個方面，對1型發(fā)作性睡病的免疫學(xué)機制進展進行概述。

1 基因多態(tài)性研究

1.1 HLA關(guān)聯(lián)性研究 從上世紀末起，發(fā)作性睡病與人類白細胞抗原(HLA)的關(guān)聯(lián)性就已被廣泛探究，其中HLA-DQB1*06：02和DQA1*01：02兩基因座的出現(xiàn)頻率與發(fā)病密切相關(guān)[5，6]。研究表明，98%的1型發(fā)作性睡病患者攜帶有HLA-DQB1*06：02，而它在正常人群中的攜帶率只有12%～38%[6]，HLA-DQB1*06：02可與HLA-DQA1*01：02共同編碼主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ型(MHC-Ⅱ)DQαβ異二聚體(DQ0602)[7]。這類異二聚體可表達于抗原呈遞細胞表面并提呈抗原肽供TCR識別。如果某個體的兩條等位基因均表達DQ0602，則發(fā)病風(fēng)險將會增加2～3倍[8]。

進一步研究提示多種編碼MHC-Ⅱ類分子的基因均與發(fā)病相關(guān)，但影響程度較小，如HLA-DQB1*03：01可讓發(fā)病風(fēng)險提升1.5倍[9]，在亞洲人群中，它可將發(fā)病年齡提前2歲[10]。保護性基因型的有大量報道，等位基因上DQ1族(包含DQA1*01，DQB1*05，DQB1*06) 基因座的存在則會降低風(fēng)險，相關(guān)機制被稱為“等位基因競爭”[10]。HLA基因區(qū)域的一些單核苷酸多態(tài)性(SNP)也與發(fā)病相關(guān)，其中SNP rs7744293與DQB1*06：02緊密連鎖，位于HLA-DP區(qū)域的 SNP rs3117242的存在則會讓發(fā)病風(fēng)險提升2.45倍[11]。

1.2非HLA基因相關(guān)性研究

近年來全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide association study，GWAS)觀察到大量非HLA基因與發(fā)作性睡病的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)T細胞受體(TCR)α基因座J區(qū)域片段的某些特定變異可以顯著提升患發(fā)作性睡病的風(fēng)險，其中rs1154155是可能性最高的一個SNP。多數(shù)TCR由α和β鏈構(gòu)成，其中α鏈由DNA的TCR基因座上V，J區(qū)域的基因片段重組并表達形成并賦予TCR高度的多樣性[12]。某些類型的TCR對特定MHC分子(如DQ*0602)可能存在特異性識別并激活免疫反應(yīng)。

其他相關(guān)的基因包括P2RY11，rs2305795A被認為是基因中與發(fā)病密切相關(guān)的一個SNP。P2RY11基因編碼一類在CD8+T細胞上表達水平很高的ATP-G蛋白偶聯(lián)受體，參與調(diào)節(jié)淋巴細胞的成熟、趨化和凋亡。2017年的一項研究報道P2RY11基因變異的患者體內(nèi)找到的變異位點，可能與CD8+T細胞的功能失調(diào)有關(guān)[13]。與P2RY11基因同在一段保守序列上的還有PPAN，EIF3G和DNMT1 基因，EIF3G 基因內(nèi)的SNPrs3826784也與本病相關(guān)，該基因在真核細胞蛋白質(zhì)翻譯過程中有重要作用[14]。一些免疫芯片研究發(fā)現(xiàn)[15]，NT1患者組織蛋白酶H (Cathepsin H，CTSH)和腫瘤壞死因子超家族成員4(TNFSF4，也被稱作 OX40L)，廣泛表達于抗原呈遞細胞內(nèi)，在抗原呈遞過程中有重要作用，能夠促進T細胞增殖。

近期，圍繞趨化因子受體1、3(CCR1、CCR3)基因的研究發(fā)現(xiàn)，CCR3基因敲除小鼠的日間睡眠片段化，當(dāng)腹腔內(nèi)被注射脂多糖后，小鼠日間覺醒時間延長而NREM睡眠時長縮短，尸檢發(fā)現(xiàn)這批小鼠外側(cè)下丘腦的Hypocretin能神經(jīng)元數(shù)目下降，提示CCR3基因在睡眠-覺醒的調(diào)節(jié)及發(fā)作性睡病的發(fā)病機制中的重要角色[16]。而CCR1基因內(nèi)的一個SNP rs3181077被發(fā)現(xiàn)可增加發(fā)病風(fēng)險，攜帶該突變基因的患者體內(nèi)CCR1 mRNA水平下降，且單核細胞遷移指數(shù)也有所降低[17]。

2 感染與疫苗

2.1 H1N1感染 2009～2010年甲型H1N1流感大流行與發(fā)作性睡病的發(fā)生密切相關(guān)。據(jù)報道，2010年流感結(jié)束后中國華北與華東地區(qū)發(fā)作性睡病的發(fā)病率是以往的3～4倍[18，19]，但與中國疫苗接種未顯示明顯相關(guān)性。隨后的實驗研究顯示：患者體內(nèi)分離出可被HCRT56-58和HCRT87-99激活的CD4+T細胞中部分亞群可被pHA1 275-287顯著激活，后者作為甲流病毒HA抗原片段與HCRT56-58和HCRT87-99具有序列上的相似性[20]，提示流感病毒抗原模擬自身抗原產(chǎn)生交叉反應(yīng)的可能。此外，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)缺少T細胞和B細胞的小鼠(重組激活基因1缺陷小鼠)感染H1N1病毒后出現(xiàn)發(fā)作性睡病樣睡眠結(jié)構(gòu)改變，解剖顯示病毒主要侵犯腦干和下丘腦區(qū)域，其中就包含Hypocretin能神經(jīng)元，提示流感病毒直接損傷神經(jīng)元的可能[21]。

2.2 疫苗 流感結(jié)束后，芬蘭和瑞典國內(nèi)報道在接種名為Pandemrix的流感疫苗后，5～19歲的青少年發(fā)作性睡病發(fā)病風(fēng)險增加了6～9倍[22]。Pandemrix不同之處來自AS03佐劑(角鯊烯和α-生育酚組合)而它含有α-生育酚這類促進免疫細胞遷移、細胞因子分泌、抗原呈遞的物質(zhì)，并通過一種被稱作“旁觀者激活”的假說引起免疫系統(tǒng)廣泛激活。Masoudi等還發(fā)現(xiàn)α-生育酚會促進Hypocretin分泌，過量的Hypocretin可能會誘發(fā)APC對Hypocretin片段提取和呈遞[23]，該實驗結(jié)論更傾向于發(fā)病機制為T細胞的特異性識別。

2.3 鏈球菌 A組溶血性鏈球菌感染與發(fā)作性睡病也有關(guān)聯(lián)。鏈球菌抗原與人類自身抗原的相似性因風(fēng)濕病而廣為人知，但既往鏈球菌感染還會使發(fā)作性睡病的發(fā)病風(fēng)險提升5倍。實驗報道患者體內(nèi)鏈球菌特異抗體如抗“O”抗體的陽性率為65%，而正常人群中只有26%[24]?；撔枣溓蚓乖?Streptococcus pyogenessuperantigens，SAgs)，可以與TCR結(jié)合并激活多種類型的T細胞[25]。鏈球菌的感染還會誘導(dǎo)T細胞分泌IL-17，并提高血腦屏障的通透性[25]，潛在增加了Hypocretin能神經(jīng)元暴露于免疫系統(tǒng)的風(fēng)險。

3 體液免疫

盡管多數(shù)研究傾向于發(fā)作性睡病1型由體液免疫途徑介導(dǎo)，但始終缺乏特異性自身抗原抗體存在的證據(jù)。2010年，一種名為同源性Tribbles2(TRIB2)蛋白自身抗體被發(fā)現(xiàn)更多地存在于患者體內(nèi)(與正常人相比14%∶5%)[26]。TRIB2廣泛表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)乃至免疫細胞內(nèi)。將含有TRIB2自身抗體的IgG注射到裸鼠的腦室內(nèi)，使其產(chǎn)生了發(fā)作性睡病樣表現(xiàn)，病理顯示裸鼠的大腦內(nèi)Hypocretin能神經(jīng)元、神經(jīng)元特異性核蛋白和突觸素均發(fā)生丟失，提示TRIB2自身抗體不只作用于Hypocretin能神經(jīng)元[27]。但目前多個研究均未發(fā)現(xiàn)1型發(fā)作性睡病患者的體內(nèi)存在任何指向Hypocretin能神經(jīng)元的自身抗體[28]或Hypocretin前體及其片段敏感的IgG[29]；多項針對已知自身抗體的篩查如anti-Ma2(參與誘發(fā)邊緣性腦炎)，NMDAR(N-methyl-D-aspartate receptor)和CASPR2(contactin-associated protein2)抗體均未有陽性發(fā)現(xiàn)[29～31]。神經(jīng)節(jié)苷脂(GM)是流感血凝素的結(jié)合位點，在一項篩查發(fā)現(xiàn)患者腦內(nèi)11種GM自身抗體的血清學(xué)檢測顯示抗GM3抗體陽性率(14.6%)顯著高于正常對照(3.5%)，且抗GM3抗體與HLA-DQB1*06：02之間有緊密關(guān)聯(lián)(P=0.016)[32]。這類研究表明，自身抗體通常陽性率低且特異性不足，其產(chǎn)生有兩種可能性：由神經(jīng)元損傷所導(dǎo)致的繼發(fā)性免疫反應(yīng)產(chǎn)生，或疾病未發(fā)生之前早已存在。

數(shù)項研究針對體液的細胞因子含量進行檢測以確定患者體內(nèi)免疫反應(yīng)的強弱。Michel等對比44例發(fā)作性睡病患者與57例其他類型睡眠增多患者的腦脊液細胞因子含量，僅有CCL3水平(趨化因子配體3)具有顯著差異(發(fā)作性睡病患者體內(nèi)水平更高)，而血清IFN-γ濃度則在患者發(fā)病初期顯著升高。IFN-γ水平的上升可以反映免疫活動的增強，而CCL3單因子的改變?nèi)狈︼@著意義[33]。Dauvilliers等的研究則發(fā)現(xiàn)患者腦脊液中僅有IL-4含量相比正常個體顯著上升[34]，另一項對9例患者和9例正常對照的研究則未發(fā)現(xiàn)任何顯著的腦脊液細胞因子水平差異[35]。而重復(fù)的血清檢驗則發(fā)現(xiàn)相對于DQ*0602陽性正常對照，發(fā)作性睡病患者外周T細胞活化程度和TNF、IL-2等細胞因子分泌量顯著上升[36]。然而，上述研究結(jié)論差異較大，體液細胞因子水平與發(fā)病機制的聯(lián)系尚不明確，考慮到睡眠節(jié)律的改變也會作用于免疫系統(tǒng)，相關(guān)改變是因是果仍需進一步探究。

4 細胞免疫

在外側(cè)下丘腦，生產(chǎn)黑色素濃集激素(Melanin-Concentrating Hormone，MCH)神經(jīng)元與Hypocretin能神經(jīng)元混合分布，但患者體內(nèi)MCH神經(jīng)元未受損傷[2]。由于中樞缺乏自身抗體與炎癥浸潤存在的證據(jù)，CD8+T細胞參與Hypocretin能神經(jīng)元特異性損傷成為另一種可能。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫耐受性來自于血腦屏障的阻隔以及神經(jīng)元中MHC的低水平表達。但T細胞仍可通過第5腰椎和脈絡(luò)叢進入顱內(nèi)。一項針對西尼羅河病毒性腦炎的實驗發(fā)現(xiàn)病毒侵入后受感染的神經(jīng)元迅速分泌CXCL10，并招募大量表達CXCR3的CD8+T細胞進入中樞[37]。Sasaki等的一項試驗用膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)作為抗原使小鼠建立免疫應(yīng)答，之后GFAP特異性CD8+T細胞會終身自發(fā)進入中樞并停留在腦膜與血管周圍，分泌少量炎性細胞因子并引發(fā)間歇性的自身免疫反應(yīng)[38]。

有趣的是，制作發(fā)作性睡病小鼠模型的方法模擬了可能的發(fā)病機制，這類轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Hypocretin能神經(jīng)元能夠表達流感病毒HA抗原蛋白，在注射HLA抗原特異性CD8+T細胞后小鼠很快出現(xiàn)Hypocretin能神經(jīng)元特異性喪失和發(fā)作性睡病樣癥狀，然而當(dāng)改為注射CD4+T細胞時則無類似改變，提示CD8+T細胞介導(dǎo)的特異性神經(jīng)元損傷的可能性[39]。

上述細胞免疫參與發(fā)作性睡病的可能機制仍然需要證據(jù)證實。值得注意的是，從H1N1的感染到發(fā)作性睡病起病常需幾個月，提示慢性免疫進程且相關(guān)免疫細胞可能只占很少一部分，因此針對發(fā)病初期患者的篩查仍難以發(fā)現(xiàn)免疫細胞和炎癥因子改變的證據(jù)。

5 組胺與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

2013年，一項針對發(fā)作性睡病患者的大腦尸檢顯示組胺能神經(jīng)元的數(shù)量平均增加了64%[40]。研究發(fā)現(xiàn)組胺與腦室內(nèi)皮細胞的結(jié)合可以提升血腦屏障的通透性，從而促進T細胞進入中樞[41]。組胺也可以促進小膠質(zhì)細胞釋放一氧化氮并通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來損傷Hypocretin能神經(jīng)元而一氧化氮對鄰近的MCH神經(jīng)元影響很小，從而解釋了Hypocretin能神經(jīng)元的特異性損傷[42]。組胺能神經(jīng)元與自身免疫因素導(dǎo)致的Hypocretin能神經(jīng)元損傷的相關(guān)性也被提出[43]。事實上，Hypocretin能神經(jīng)元相對于MCH神經(jīng)元更易受損傷，興奮性毒素如喹啉酸的作用可以通過NMDA 受體的異常激活顯著減少小鼠Hypocretin能神經(jīng)元數(shù)量，而相同環(huán)境下的MCH神經(jīng)元數(shù)量無明顯下降[44]。目前臨床證據(jù)顯示發(fā)作性睡病患者的腦脊液組胺水平低于或組胺通路信號傳遞受阻[45，46]。組胺參與發(fā)作性睡病的發(fā)生機制作為一類新觀點亟需進一步試驗加以明確。

6 結(jié) 語

在1型發(fā)作性睡病的免疫機制中，基因和環(huán)境因素從不同角度施加影響，導(dǎo)致腦內(nèi)特異性Hypocretin能神經(jīng)元的損毀，但仍有許多重要問題亟待研究明確。目前已發(fā)現(xiàn)眾多易感基因和環(huán)境誘發(fā)因素的存在，但考慮到相對較低的發(fā)病率，哪項因素才是發(fā)病的關(guān)鍵？小膠質(zhì)細胞在發(fā)病進程占據(jù)怎樣的地位，尚無相關(guān)實驗報道。炎癥因子、自身抗體水平是否因為患病時間的延長而逐漸下降，以至于無法檢測？未來對流感患者或發(fā)作性睡病患者發(fā)病超早期，甚至臨床不典型期進行特異性抗體檢測和中樞的細胞免疫相關(guān)檢測，可能對發(fā)病機制的研究有所突破。此外，對發(fā)作性睡病機制的探究也將有助于高危人群的識別與預(yù)防，對核心免疫通路的理解將為治療開創(chuàng)新路。