高眼壓狀態(tài)下角膜內(nèi)皮的損傷與修復(fù)

曲勃，劉丹霞，張旺

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院，遼寧省晶狀體學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110005）

青光眼是全球第二大致盲性眼病，病理性眼壓增高是其主要危險(xiǎn)因素。根據(jù)眼壓升高時(shí)房角的狀態(tài)，將原發(fā)性青光眼分為原發(fā)性閉角型青光眼及原發(fā)性開角型青光眼。由于前房角被周邊虹膜組織機(jī)械性阻塞導(dǎo)致房水流出受阻，此時(shí)眼壓急劇升高，即為原發(fā)性青光眼急性大發(fā)作。高眼壓對(duì)視野及視神經(jīng)產(chǎn)生損害同時(shí)，也損傷角膜，尤其是角膜內(nèi)皮的功能。高眼壓是損傷角膜內(nèi)皮細(xì)胞的重要因素之一，為更深入了解高眼壓狀態(tài)下角膜內(nèi)皮的損傷與修復(fù)，本文從正常角膜內(nèi)皮細(xì)胞的生理結(jié)構(gòu)及特性、角膜內(nèi)皮細(xì)胞的測(cè)量、高眼壓對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的影響及損傷機(jī)制、角膜內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)等方面闡述高眼壓對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的影響，為青光眼患者尤其是急性閉角型青光眼患者的治療及術(shù)后評(píng)估提供可靠依據(jù)。

1 正常角膜內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及生理特性

角膜內(nèi)皮細(xì)胞是位于角膜最內(nèi)面的單層六角形上皮細(xì)胞，每個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞高約5 μm，寬約18～20 μm，細(xì)胞膜后表面可見20～30個(gè)微絨毛突向前房。角膜內(nèi)皮細(xì)胞膜以閉鎖小帶、閉鎖斑及橋粒緊密連接形成連接復(fù)合體。角膜內(nèi)皮細(xì)胞通過“泵－漏機(jī)制”為角膜提供充足的營(yíng)養(yǎng)并維持角膜透明。角膜內(nèi)皮將前房?jī)?nèi)的水及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)“漏”給角膜其余結(jié)構(gòu)，并通過主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)“泵”出角膜實(shí)質(zhì)內(nèi)的水分，以維持角膜透明［1］。

通常成年人角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度較穩(wěn)定，隨年齡的增長(zhǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度逐漸下降，且角膜內(nèi)皮的多形性逐年增加［2］。角膜內(nèi)皮細(xì)胞受損會(huì)導(dǎo)致角膜內(nèi)皮細(xì)胞的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)功能及角膜內(nèi)皮層間的復(fù)合連接受損，水分進(jìn)入角膜基質(zhì)層，使基質(zhì)層內(nèi)膠原纖維失去正常規(guī)則的排列，纖維間隙擴(kuò)大，基質(zhì)層含水量增多，角膜混濁水腫，嚴(yán)重者出現(xiàn)大泡性角膜病變。一般認(rèn)為，當(dāng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度下降至400～700/mm2時(shí)，會(huì)出現(xiàn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞水腫，甚至大泡性角膜病變［2］。

2 角膜內(nèi)皮的檢測(cè)及意義

角膜內(nèi)皮細(xì)胞損傷后如何進(jìn)行測(cè)量，也是目前針對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行的研究的熱點(diǎn)之一。角膜內(nèi)皮細(xì)胞的檢測(cè)方法主要為非接觸角膜內(nèi)皮鏡及共聚焦顯微鏡。非接觸角膜內(nèi)皮鏡可對(duì)角膜內(nèi)皮進(jìn)行定性及定量檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)包括角膜內(nèi)皮密度、中央角膜厚度、平均細(xì)胞面積、六邊形細(xì)胞比率等，可觀察角膜內(nèi)皮早期損傷和估測(cè)角膜內(nèi)皮的功能。但在角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度減少及角膜有病變時(shí)，共聚焦顯微鏡能夠提供實(shí)時(shí)的高分辨率和對(duì)比率的圖像甚至3D圖像，對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞功能的評(píng)估具有一定的優(yōu)越性［3］。目前某些實(shí)驗(yàn)室采用的是更為先進(jìn)的X線散射技術(shù)及三維掃描電子顯微鏡，它們可從分子層面顯示組織的形狀和力學(xué)性質(zhì)［4］。角膜內(nèi)皮細(xì)胞的檢測(cè)能觀察角膜內(nèi)皮的損傷，估測(cè)角膜內(nèi)皮的功能，為臨床提供基礎(chǔ)。

3 角膜內(nèi)皮的增殖抑制

既往研究證明角膜內(nèi)皮細(xì)胞在生理狀態(tài)下無(wú)法增殖。人的角膜內(nèi)皮細(xì)胞屬于終末細(xì)胞，角膜內(nèi)皮細(xì)胞始終停留在細(xì)胞周期的G1期，無(wú)法進(jìn)入S期［5］。人角膜內(nèi)皮在生理狀態(tài)下無(wú)法進(jìn)行增殖的主要原因如下：（1） 角膜內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接使角膜內(nèi)皮表現(xiàn)為強(qiáng)烈的接觸抑制，這種接觸抑制可使P27kip1蛋白的表達(dá)上調(diào)，P27kip1是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子，其參與細(xì)胞周期調(diào)控，使角膜內(nèi)皮細(xì)胞停留在細(xì)胞周期的G1期，無(wú)法進(jìn)行增殖活動(dòng)［4］；（2）促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的因子 （表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等） 在前房中濃度極低，且角膜內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子無(wú)應(yīng)答［6-7］；（3） 前房中存在細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2 （transforming growth factor-β2，TGF-β2） ，TGF-β2在G1/G0期通過激活轉(zhuǎn)錄因子p53而增加細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子的表達(dá)量，抑制細(xì)胞進(jìn)入S期［6-7］；（4） 角膜的解剖位置決定了角膜內(nèi)皮長(zhǎng)期暴露于紫外線照射，長(zhǎng)期紫外線照射導(dǎo)致的光損傷可引起活性氧自由基積累，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起細(xì)胞損傷包括DNA的損傷，阻礙細(xì)胞增殖［6-7］。

4 角膜內(nèi)皮的增殖

前文闡述了角膜內(nèi)皮細(xì)胞由于存在增殖抑制而在體內(nèi)無(wú)法進(jìn)行增殖，然而目前多種證據(jù)表明，角膜內(nèi)皮細(xì)胞在特定情況下具有增殖能力：角膜內(nèi)皮周邊部角膜內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物，表明至少部分角膜內(nèi)皮細(xì)胞擁有增殖能力［8-10］；在異體角膜移植術(shù)后，患者的角膜植床上發(fā)現(xiàn)供體與受體角膜內(nèi)皮細(xì)胞混合體［11］；角膜緣內(nèi)皮細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移后可修復(fù)角膜后彈力層［12］。

5 眼壓對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的影響

眼壓除能夠損傷角膜內(nèi)皮細(xì)胞外，還對(duì)角膜內(nèi)皮的形態(tài)及功能有一定影響。PATEL等［13］發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，但移植到活體后，其外形逐漸向六邊形過渡，提示角膜內(nèi)皮所處的環(huán)境對(duì)角膜內(nèi)皮的形態(tài)具有一定的影響。幸正茂等［14］發(fā)現(xiàn)，仿生條件下培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞比在普通無(wú)壓力下培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞具有更高的活性，但高壓力和非生理性波動(dòng)的壓力會(huì)影響角膜內(nèi)皮的正常形成及生存，說(shuō)明控制眼壓正常是角膜內(nèi)皮的形態(tài)及功能形成的條件之一。

正常的眼壓可維持角膜的形態(tài)和功能，但眼壓過高可對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞造成損傷。研究［15］表明，眼壓的增高和持續(xù)時(shí)間與角膜內(nèi)皮細(xì)胞損傷呈正相關(guān)。通過對(duì)兔高眼壓模型的電鏡觀察［16］，發(fā)現(xiàn)高眼壓可使角膜內(nèi)皮細(xì)胞膜破損，細(xì)胞腫脹，細(xì)胞器顆粒粗大，持續(xù)高眼壓可進(jìn)一步導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞崩解，胞質(zhì)脫落，胞核裸露，繼而出現(xiàn)細(xì)胞缺損區(qū)，修復(fù)細(xì)胞缺損區(qū)時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞異形明顯。

6 高眼壓損傷角膜內(nèi)皮的機(jī)制

高眼壓對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的損傷機(jī)制目前尚不明確。眾多學(xué)者通過體外加壓對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得出不同的損傷機(jī)制，如角膜內(nèi)皮細(xì)胞缺氧、角膜內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物堆積、角膜內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等。

6.1 缺氧

梁都雅等［17］認(rèn)為高眼壓對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的損傷可能是機(jī)械性損傷，與缺氧相關(guān)。角膜的營(yíng)養(yǎng)代謝與角膜神經(jīng)支配有著密切關(guān)系。眼壓增高壓迫角膜感覺神經(jīng)使角膜營(yíng)養(yǎng)障礙，同時(shí)靜脈受壓回流受阻及角膜緣血管網(wǎng)灌流量減少導(dǎo)致角膜缺氧，二者供給內(nèi)皮細(xì)胞的能量減少，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損。同時(shí)，缺氧會(huì)抑制內(nèi)皮細(xì)胞泵的有氧代謝，使ATP減少，從而引起內(nèi)皮泵對(duì)離子的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)功能障礙，導(dǎo)致房水動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變，最終導(dǎo)致角膜內(nèi)皮損傷［18］。

6.2 代謝產(chǎn)物堆積

高眼壓對(duì)角膜內(nèi)皮的損傷與高眼壓時(shí)房水循環(huán)受阻造成的代謝產(chǎn)物堆積相關(guān)。MORTENSEN等［19］在體外高壓力狀態(tài)下培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞，且每8 h更換培養(yǎng)液，發(fā)現(xiàn)在高壓力狀態(tài)下角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量并未減少，證實(shí)高眼壓對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的損傷與代謝產(chǎn)物堆積相關(guān)。

6.3 凋亡

凋亡是由基因調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡。梁玲玲等［20］利用體外壓力仿生培養(yǎng)，認(rèn)為高壓力對(duì)角膜內(nèi)皮的損傷是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡引起的。凋亡途徑主要有內(nèi)源性途徑和外源性途徑。梁玲玲等［21］進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，高壓力下促凋亡蛋白p53表達(dá)增強(qiáng)與凋亡抑制因子之一的bcl-2失衡，誘發(fā)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑的啟動(dòng)，內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑啟動(dòng)后，細(xì)胞色素C從線粒體內(nèi)釋放至細(xì)胞質(zhì)，其與凋亡相關(guān)因子1結(jié)合形成凋亡小體，啟動(dòng)caspase聯(lián)級(jí)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

7 角膜內(nèi)皮損傷后的修復(fù)

由于角膜內(nèi)皮的增殖抑制，人角膜內(nèi)皮損傷后，主要通過損傷區(qū)周邊內(nèi)皮細(xì)胞的擴(kuò)大及移行修復(fù)缺損區(qū)。損傷區(qū)邊緣的細(xì)胞通過相互移動(dòng)將周邊的細(xì)胞向缺損區(qū)牽拉，重新建立細(xì)胞連接。同時(shí)，細(xì)胞間的接觸抑制使內(nèi)皮細(xì)胞的擴(kuò)大與移行終止。一般認(rèn)為，角膜內(nèi)皮細(xì)胞的移行與細(xì)胞內(nèi)的肌動(dòng)蛋白相關(guān)。Rho相關(guān)激酶通路可通過調(diào)控肌動(dòng)蛋白張力纖維束的形成和細(xì)胞收縮，促進(jìn)細(xì)胞的黏附肌運(yùn)動(dòng)作用，Rho相關(guān)激酶抑制因子可通過誘導(dǎo)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的重塑、粘連和細(xì)胞移行，促進(jìn)角膜內(nèi)皮愈

合［22］。

角膜內(nèi)皮細(xì)胞始終處于細(xì)胞周期中的G1期，而非退出細(xì)胞增殖周期，可由此推斷，角膜內(nèi)皮細(xì)胞在生理?xiàng)l件下具有增殖潛能。多項(xiàng)研究［23］表明，人角膜內(nèi)皮細(xì)胞中存在生長(zhǎng)因子，如表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，與角膜內(nèi)皮損傷修復(fù)相關(guān)。表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子可促進(jìn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，且在一定濃度內(nèi)具有劑量依賴性。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子刺激角膜內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂、趨化、移行、損傷修復(fù)及改變角膜內(nèi)皮細(xì)胞的形狀，且在一定濃度內(nèi)具有劑量依賴性。各因子對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)具有協(xié)同作用。由于血-房水屏障的作用，前房中缺乏足夠濃度的生長(zhǎng)因子，且由于TGF-β2的抑制作用，角膜內(nèi)皮細(xì)胞僅出現(xiàn)輕微的增殖表現(xiàn)，無(wú)法完成整個(gè)增殖周期。

綜上所述，角膜內(nèi)皮細(xì)胞是保持角膜透明的基本，角膜內(nèi)皮在人體內(nèi)無(wú)法增殖，損傷后主要依靠擴(kuò)大與移行修復(fù)缺損區(qū)，在臨床上可表現(xiàn)為角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度減低、內(nèi)皮細(xì)胞六角細(xì)胞比例下降以及中央角膜厚度增加等。急性閉角型青光眼高眼壓在短時(shí)間內(nèi)即可對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生損傷，快速控制眼壓是減少角膜內(nèi)皮細(xì)胞損傷、挽救青光眼患者視力的當(dāng)務(wù)之急。高眼壓持續(xù)時(shí)間與角膜內(nèi)皮損傷呈正比，若不能及時(shí)控制高眼壓，角膜內(nèi)皮細(xì)胞持續(xù)受損，最終會(huì)導(dǎo)致角膜內(nèi)皮失代償，甚至出現(xiàn)大泡性角膜病變。角膜內(nèi)皮移植是解決此問題的唯一方法。但由于缺少供體及供體年齡的限制，角膜內(nèi)皮細(xì)胞移植具有明顯局限性。具有生物活性的組織工程角膜是目前角膜內(nèi)皮研究的一大熱點(diǎn)，而角膜內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)是組織工程角膜的首選。目前，對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的觀察及研究主要集中于動(dòng)物模型及體外培養(yǎng)，對(duì)人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的觀察及研究尚少。基于目前的研究成果，角膜內(nèi)皮盲的患者終將看到光明。