外泌體與缺血性卒中的研究進(jìn)展

展珊珊，王 銳，王毅飛綜述，付 錦審校

腦血管疾病是危害人類健康的重大疾病，全球每年約有1500萬人患有腦卒中，約有500萬人死亡，是造成死亡的第二大病因,也是長期致殘的主要原因[1]。腦卒中分為缺血性卒中和出血性卒中，其中缺血性卒中占全部卒中的73%～86%[2]。對(duì)于缺血性卒中目前除了超早期靜脈溶栓或血管內(nèi)治療外尚無有效治療方法。近年來，外泌體因其獨(dú)特的特點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注如低免疫原性、低毒性和生物降解性、穿越血腦屏障(Blood brain barrier，BBB)的能力等，在缺血性腦卒中的診斷預(yù)后及治療中發(fā)揮重要作用。

1 外泌體特點(diǎn)及標(biāo)志

外泌體是細(xì)胞外囊泡的一種，直徑約為30～100 nm。外泌體通常包裹在脂質(zhì)雙層膜中，脂質(zhì)雙層膜用于運(yùn)輸和保護(hù)外泌體腔內(nèi)物質(zhì)免受細(xì)胞外環(huán)境的破壞[3]。2007年Valadi等人首次證實(shí)外泌體內(nèi)存在RNA，包括mRNA及miRNA和其他非編碼RNA[4]。之后又發(fā)現(xiàn)外泌體還攜帶單鏈DNA、雙鏈DNA、擴(kuò)增的致癌基因序列、轉(zhuǎn)座因子和線粒體DNA[5,6]。外泌體還可以攜帶蛋白質(zhì)和多肽。在外泌體攜帶的蛋白中一些為常見蛋白質(zhì)與細(xì)胞類型無關(guān)，目前認(rèn)為CD9、Alix、CD63、TSG101和CD81都可以用來作為外泌體識(shí)別或區(qū)別其他細(xì)胞外囊泡的標(biāo)志蛋白[4,7]。還有一些涉及外泌體生物發(fā)生的、表現(xiàn)出組織/細(xì)胞類型特異性的蛋白質(zhì)[7]，目前研究表明，外泌體內(nèi)含有多種參與腦修復(fù)功能的蛋白質(zhì)，包括突觸傳遞和軸突生長等[8,9]。

人體幾乎所有的細(xì)胞中均可釋放出外泌體，并且廣泛存在于人體體液中，在特定條件下在體液中遠(yuǎn)距離傳播[3]。最近發(fā)現(xiàn)，在卒中后炎癥的條件下[10]，外泌體通過被腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)吞作用將其內(nèi)化后穿越BBB進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。

2 外泌體作為缺血性卒中的早期診斷及預(yù)后的標(biāo)志物

缺血性腦卒中時(shí)外泌體可從腦神經(jīng)細(xì)胞中合成釋放并可通過BBB在外周血中檢測到。此外，血液細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞也可在腦卒中后作出應(yīng)答并釋放外泌體到血液中。因此，外泌體可能是反映病理進(jìn)展和促進(jìn)卒中恢復(fù)的生物標(biāo)志物。

Ji等人[11]納入65名急性缺血性卒中患者以及66名非卒中志愿者作為對(duì)照組。通過檢測腦源外泌體miR-9和miR-124表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，急性缺血性卒中患者血清外泌體濃度以及血清腦源外泌體miR-9、miR-124中位數(shù)水平顯著升高。并且血清外泌體miR-9和外泌體miR-124水平與NIHSS評(píng)分、梗死體積呈正相關(guān)。因此，血清腦源外泌體miR-9和miR-124是診斷缺血性卒中和評(píng)估缺血性損傷程度的有前途的生物標(biāo)志物。Chen等人[12]也發(fā)現(xiàn)血清外泌體miR-223可作為急性缺血性腦卒中發(fā)病72 h內(nèi)血清標(biāo)志物，其表達(dá)水平與發(fā)病時(shí)NIHSS評(píng)分呈正相關(guān)，并且血清外泌體miR-223表達(dá)水平高，患者短期預(yù)后差。

在溶栓時(shí)間窗內(nèi)TIA與缺血性腦卒中的鑒別是困難的。應(yīng)用最新的成像技術(shù)雖然可以在時(shí)間窗口內(nèi)診斷TIA，但是其檢查時(shí)間延遲和價(jià)格昂貴。有研究[13]通過TUNEL檢測在不同缺血時(shí)間的腦組織凋亡情況，發(fā)現(xiàn)腦缺血5 min時(shí)凋亡發(fā)生與假手術(shù)組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而腦缺血10 min時(shí)與假手術(shù)組及腦缺血5 min組相比凋亡明顯增加。同步檢測血清及腦脊液外泌體miR-122-5p和miR-300-3p表達(dá)發(fā)現(xiàn)血漿外泌體miR-122-5p在假手術(shù)組及腦缺血5 min組表達(dá)無明顯差異而腦缺血10 min組表達(dá)升高，miR-300-3p在腦缺血5 min組與假手術(shù)組相比表達(dá)升高而在腦缺血10 min組表達(dá)又減少。提示外泌體miR-122-5p和外泌體miR-300-3p可能是TIA的生物標(biāo)志物。

缺血性腦卒中依據(jù)發(fā)病時(shí)間可以分為不同階段，早期、準(zhǔn)確的診斷可大大改善患者預(yù)后。缺血性腦卒中后有許多生物標(biāo)志物，如蛋白質(zhì)、核酸或代謝物，它們可能與缺血性腦卒中的特定生理和病理過程有關(guān)，然而它們的特異性和區(qū)分腦卒中不同階段特別是超急性期或類卒中的能力尚不確定[14]。Wang等人[15]研究血漿來源外泌體miR-21-5p和外泌體miR-30a-5p在缺血性腦梗死不同時(shí)期的表達(dá)情況。研究發(fā)現(xiàn)外泌體miR-21-5p和miR-30a-5p是診斷缺血性腦梗死和鑒別缺血性腦梗死超急性期(小于6 h)、亞急性期(8～14 d)和恢復(fù)期(大于14 d)的有價(jià)值的生物標(biāo)志物，尤其是miR-30a-5p可用于缺血性腦梗死超急性期的診斷，進(jìn)而對(duì)缺血性腦梗死的溶栓治療中的可能具有臨床價(jià)值。

值得注意的是，雖然循環(huán)miRNA和外泌體miRNA都是缺血性卒中的新的潛在血清標(biāo)志物，循環(huán)miRNA包含外泌體miRNA，但二者不一定具有相關(guān)性。一項(xiàng)研究[16]在大鼠短暫性腦缺血模型及大鼠永久性缺血模型中定量測定血清外泌體miR-126總水平，同時(shí)測量梗死和神經(jīng)預(yù)后。結(jié)果表明，無論在永久性還是暫時(shí)性缺血模型中，外泌體miR-126缺血后不同時(shí)間點(diǎn)變化相同。而血清miR-126在永久缺血模型與短暫缺血模型缺血相同時(shí)間段變化不同。這說明雖然循環(huán)miRNA和外泌體miRNA都可作為缺血性卒中的血清標(biāo)志物，即使在同一疾病過程中的同一個(gè)循環(huán)miRNA或外泌體miRNA二者表達(dá)存在不同機(jī)制。

內(nèi)皮細(xì)胞及血小板在動(dòng)脈粥樣硬化腦梗死發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Edward等人[17]在18例缺血性腦血管病患者及年齡和性別匹配的18例對(duì)照者中檢測內(nèi)皮細(xì)胞來源外泌體和血小板來源外泌體中蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在缺血性腦血管病患者中無論是血漿中的促動(dòng)脈粥樣硬化蛋白還是內(nèi)皮細(xì)胞或血小板來源的外泌體中促動(dòng)脈粥樣硬化蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。此外，與對(duì)照組相比，內(nèi)皮細(xì)胞來源外泌體中YAP蛋白水平較高，P(S127)-YAP蛋白表達(dá)水平較低，這與動(dòng)脈粥樣硬化中機(jī)械力敏感系統(tǒng)活性增強(qiáng)是一致的。這表明檢測外泌體蛋白及其來源作為生物標(biāo)志物具有潛在的臨床價(jià)值。

3 外泌體與缺血性卒中的治療

干細(xì)胞為治療缺血性腦卒中被證明可改善神經(jīng)系統(tǒng)預(yù)后。近期研究表明干細(xì)胞治療缺血性腦卒中療效的主要機(jī)制不是通過細(xì)胞替代或移植細(xì)胞分化到腦細(xì)胞來介導(dǎo)的，而是通過干細(xì)胞分泌旁分泌因子促進(jìn)缺血性腦卒中后神經(jīng)系統(tǒng)癥狀改善[18]。因此，卒中后靜脈注射無細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體治療為腦卒中提供了一種新的治療方法，具有替代細(xì)胞治療的潛力。

Xin等人[19]體外在間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)細(xì)胞中過表達(dá)miR-133b后提取外泌體(Ex-miR-133b+)給與MCAO大鼠治療，通過綠色熒光蛋白標(biāo)記外泌體顯示，來自MSCs釋放的外泌體miR-133b向星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的轉(zhuǎn)移，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，進(jìn)而有利于腦卒中后神經(jīng)突出重塑和功能恢復(fù)。進(jìn)一步對(duì)Ex-miR-133b+改善了卒中后神經(jīng)功能恢復(fù)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)[20]，與Ex-Naive治療相比Ex-miR-133b+顯著增加OGD后星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放的外泌體。與使用Ex-Con處置的OGD星形膠質(zhì)細(xì)胞外泌體相比，使用Ex-miR-133b+處置的OGD星形膠質(zhì)細(xì)胞獲得的外泌體治療能顯著增加培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)胚胎神經(jīng)元的神經(jīng)突分支和伸長。這表明，Ex-miR-133b+外泌體能通過刺激星形細(xì)胞釋放神經(jīng)外泌體，進(jìn)一步增強(qiáng)治療效果。

Xin等人另一項(xiàng)研究[21]在大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞模型中(MCAo)尾靜脈注入從體外MSCs中提取的外泌體，發(fā)現(xiàn)從體外MSCs中提取的外泌體顯著增強(qiáng)神經(jīng)突重塑、神經(jīng)發(fā)生和血管生成，改善卒中大鼠的功能恢復(fù)。之后又后續(xù)報(bào)道[22]體外收集過表達(dá)miR-17-92簇的MSCs來源外泌體給與大鼠腦缺血模型后尾靜脈注射，發(fā)現(xiàn)體外過表達(dá)miR-17-92簇的MSC來源的外泌體與MSC來源的外泌體相比可顯著促進(jìn)卒中后神經(jīng)可塑性和功能恢復(fù)。由此可見，通過調(diào)控外泌體內(nèi)分子可以增強(qiáng)療效。

Xiao等人[23]在骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)外泌體與OLs共培養(yǎng)后進(jìn)行OGD處理，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的BMSCs來源的外泌體miR-134通過直接抑制caspase-8的表達(dá)和活性顯著抑制OLs細(xì)胞凋亡。

脂肪源性干細(xì)胞(adipose derived stem cells，ADSCs)已被證實(shí)可促進(jìn)腦卒中后腦血管重構(gòu)。Yang等人[24]通過體外模型證實(shí)ADSCs-Exos促進(jìn)體外OGD后BMECs血管生成，并且外泌體來源的miR-181b-5p在體外通過直接靶向抑制TRPM7促進(jìn)OGD后BMEC血管生成。

在腦卒中后的恢復(fù)期，軸突再生與功能恢復(fù)有關(guān)，但軸突再生受到星形膠質(zhì)細(xì)胞瘢痕形成的抑制。Hira等人[25]研究發(fā)現(xiàn)在腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭惺褂肧ema3A抑制劑(Sema3A-I)可促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)及減少活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞。進(jìn)一步研究表明Sema3A-I促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)機(jī)制是通過促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的外泌體對(duì)神經(jīng)軸突發(fā)揮的作用。

除卒中后靜脈注射無細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體治療方式外，近期帶有靶向能力的裝載分子或藥物的外泌體治療是一種新的外泌體治療方式。

Yang等人[26]通過帶有神經(jīng)元特異性靶向的Lamp2b-RVG修飾外泌體中轉(zhuǎn)染miR-124模擬物，之后對(duì)缺血小鼠模型進(jìn)行靜脈注射治療，發(fā)現(xiàn)帶有miR-124的Lamp2b-RVG修飾外泌體可以明顯定位到受損腦區(qū)，并且促進(jìn)大腦皮質(zhì)的神經(jīng)祖細(xì)胞轉(zhuǎn)化神經(jīng)元表型,并通過強(qiáng)健的皮質(zhì)神經(jīng)發(fā)生保護(hù)缺血性損傷。

最近有研究者[27]通過一種簡單、快速和生物正交化學(xué)方法將c肽(RGDyK)與外泌體表面結(jié)合。構(gòu)成cRGD-Exo。在MCAO小鼠模型中，cRGD-Exo在靜脈給藥后有效的靶向缺血性腦損傷區(qū)域。

因此，修飾后的外泌體可用于靶向腦組織并輸送基因藥物進(jìn)行治療，具有很大的臨床應(yīng)用潛力。

4 展 望

目前，缺血性腦卒中的康復(fù)期治療依然是腦卒中治療的難點(diǎn)。外泌體的發(fā)現(xiàn)推動(dòng)治療方法的多樣化。在缺血性腦卒中的治療領(lǐng)域，干細(xì)胞外泌體給藥治療由于其靶向能力不足限制了其臨床應(yīng)用。因此，需開發(fā)效率更高、靶向性更好的修飾后外泌體載體。