糖酵解代謝旁路與樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受的相關(guān)性

劉會(huì)佳，武志坤，崔 萌，鄧曉紅綜述，宋秀娟，侯慧清，郭 力審校

樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)是人類(lèi)目前已知的免疫系統(tǒng)功能最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC)，其功能為高效地識(shí)別、捕獲、呈遞抗原，從而激活抗原特異性T細(xì)胞，啟動(dòng)免疫應(yīng)答，因此在固有免疫應(yīng)答(innate immune response)及適應(yīng)性免疫應(yīng)答(adaptive immune response)中均具有重要作用。

DC自1973年被加拿大科學(xué)家Steinman[1]發(fā)現(xiàn)以來(lái)，一直是自身免疫性疾病研究的重點(diǎn)。近來(lái)關(guān)于DC代謝的研究越來(lái)越多，研究發(fā)現(xiàn)不同類(lèi)型的DC具有不同的代謝旁路，用以滿足其生物學(xué)代謝功能的需求；同時(shí)，不同的代謝旁路也決定了免疫細(xì)胞的表型及功能。

DC必須在激活或成熟后才能發(fā)揮誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的作用。因此，本文通過(guò)對(duì)促DC成熟的代謝通路進(jìn)行綜述，以期為研究抑制DC成熟、誘導(dǎo)免疫耐受及自身免疫性疾病的臨床治療提供新的方向。

1 DC分類(lèi)

DC據(jù)來(lái)源分為髓樣DC(myeloid dendritic cell,mDC)與漿樣DC(plasmacytoid dendritic cell,pDC)，在人類(lèi)即為DC1與DC2。DC1與粒細(xì)胞、單核細(xì)胞有共同的前體細(xì)胞，能分化為巨噬細(xì)胞，分泌白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-2、IL-12、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)；DC2與T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞有共同的前體細(xì)胞，能夠分化發(fā)育為淋巴細(xì)胞，通過(guò)Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)識(shí)別病毒和自身核酸結(jié)構(gòu)，分泌干擾素α(interferon-α,IFN-α)[2]。二者均起源于骨髓中CD34+多能造血干細(xì)胞(CD34+Hematopoetic progenitor cell,CD34+HPC)，而后由骨髓遷移到外周血中，到達(dá)各個(gè)淋巴器官。

DC根據(jù)成熟程度分為成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(mature dendritic cell,mDC)及未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(immature dendritic cell,imDC)，二者在表型及功能上均有所不同，DC具有根據(jù)其自身成熟狀態(tài)誘導(dǎo)或抑制免疫反應(yīng)的能力。ImDC表達(dá)一系列的模式識(shí)別受體，包括TLRs以保證當(dāng)炎癥刺激及微生物侵襲時(shí)能夠識(shí)別并快速應(yīng)答，功能主要為識(shí)別、攝取、呈遞抗原。其常規(guī)存在于除腦以外身體的其他非淋巴組織，處于免疫耐受狀態(tài)；當(dāng)受到炎癥信號(hào)如脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激時(shí)，DC遷移至次級(jí)淋巴器官并誘導(dǎo)主要組織相容性復(fù)合體I/II(major histocompatibility complex I/II,MHC I/II)，基因編碼趨化因子受體、共刺激分子、細(xì)胞因子的表達(dá)，活化為mDC，攝取抗原能力下降，加工、提呈抗原能力增強(qiáng)，活化初始T細(xì)胞，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答[3]。

DC根據(jù)其分布部位大致可分為淋巴組織中DC：如濾泡樣DC(follicular DC,fDC)、并指狀DC(interdigitating cell,iDC)等；非淋巴組織中DC：如間質(zhì)性DC、朗罕細(xì)胞(langerhans cell,LC)等；以及血液中DC。DC根據(jù)導(dǎo)致的免疫反應(yīng)類(lèi)型分為啟動(dòng)免疫應(yīng)答DC(immunogenic DC,iDC)和誘導(dǎo)免疫耐受DC(tolerogenic dendritic cell,tol-DC)。

2 DC誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的作用

當(dāng)機(jī)體受到炎性刺激信號(hào)如病原體、TNF-α等刺激后，DC主要通過(guò)3類(lèi)信號(hào)向初始T細(xì)胞傳遞信息，激活初始T細(xì)胞，起到誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的作用。第一信號(hào)：DC攝取抗原后，處理成抗原肽- MHC復(fù)合物表達(dá)于細(xì)胞表面，被T細(xì)胞表面的T細(xì)胞抗原受體(T cell receptor,TCR)識(shí)別；第二信號(hào)：DC表面表達(dá)共刺激分子80(costimulatory molecules 80,CD80)、CD86、CD40等，必須同第一信號(hào)共同刺激T細(xì)胞才能使其充分活化，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)，故又稱(chēng)協(xié)同刺激信號(hào)；第3信號(hào)：DC通過(guò)分泌IL-6、IL-12、IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming growth factor-β,TGF-β)、TNF-γ等決定初始T細(xì)胞分化為效應(yīng)T細(xì)胞還是輔助性T細(xì)胞，激活或抑制免疫反應(yīng)。因此，DC是固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁。

3 DC的糖酵解代謝旁路(glycolysis pathway)

代謝在免疫細(xì)胞中的作用至關(guān)重要，第一，它是提供能量的一種方式，用于滿足細(xì)胞所需能量，維持其生存、增殖、細(xì)胞因子的分泌等功能。在大部分的細(xì)胞中，氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)提供了其中大部分的能量[4]。第二，提供原料進(jìn)行DNA修飾及蛋白質(zhì)合成。與免疫相關(guān)的代謝途徑包括以下6種：糖酵解、三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環(huán)、磷酸戊糖途徑(Pentose Phosphate Pathway,PPP)、脂肪酸氧化、脂肪酸合成、氨基酸代謝，可影響免疫細(xì)胞的功能[5]。DC通過(guò)發(fā)育、靜止、激活來(lái)發(fā)揮其不同階段的生物學(xué)功能。在DC發(fā)育成熟的過(guò)程中，不同階段的DC代謝旁路也不同，用以滿足其生物學(xué)功能的需求,這也使得我們通過(guò)調(diào)節(jié)DC代謝改變DC表型和功能，達(dá)到誘導(dǎo)免疫耐受的目的具有可能性。

在生物供能的角度講，與氧化磷酸化相比，糖酵解產(chǎn)生ATP的能效低，但產(chǎn)生速度卻較快。在發(fā)生免疫應(yīng)答時(shí)，糖酵解可以維持細(xì)胞的能量供給，并保護(hù)DC的生存能力。當(dāng)感染、炎癥發(fā)生時(shí)，氧供給不足，此時(shí)糖酵解可以更好的發(fā)揮作用，快速提供ATP，進(jìn)而促進(jìn)合成、分泌DC成熟所需物質(zhì)，如：致炎性細(xì)胞因子等。

廣義的糖酵解途徑是指在缺氧或無(wú)氧條件下于胞液中將葡萄糖分解代謝為丙酮酸并產(chǎn)生少量三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)的過(guò)程。生成中間代謝產(chǎn)物：6磷酸果糖(glucose-6-phosphate,G6P)后的代謝主要有兩條分支，其中一條為PPP，可以生成核酸和脂肪酸合成所需的重要輔助因子-NADPH。另一條為丙酮酸途徑，生成的丙酮酸一部分進(jìn)一步代謝轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?、NAD+和ATP，反饋?zhàn)饔糜谔墙徒獯x旁路，另一部分進(jìn)入線粒體內(nèi)生成乙酰輔酶A(acetyl-CoA)，參與到TCA循環(huán)中[6]。丙酮酸的代謝方向由PKM1和PKM2決定。PKM1能促進(jìn)丙酮酸在線粒體的氧化；決定缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)可以通過(guò)上調(diào)乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase A,LDHA)的表達(dá)促進(jìn)丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，PKM2可以促進(jìn)HIF1α的表達(dá)。目前，對(duì)于DC中PKM1和PKM2的功能還有待進(jìn)一步研究。

3.1 P13K-AKT-mTOR通路 磷脂酰激酶3羥基酶(phosphoinositide 3 kinase,PI3K)-AKT是一類(lèi)廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，主要參與細(xì)胞分化和抑制凋亡。AKT是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，其活性主要與磷酸化水平相關(guān)。AKT作為PI3K下游的主要目標(biāo)因子，刺激細(xì)胞膜表面的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)葡萄糖聚集，促進(jìn)糖酵解快速發(fā)生[7]，增強(qiáng)細(xì)胞無(wú)氧糖酵解水平。AKT下游激酶雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)也是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，有兩種亞型mTOR C1和mTOR C2，在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝中具有重要作用。P13K-AKT信號(hào)通路激活后，活化mTOR促使AKT磷酸化，進(jìn)一步解除增強(qiáng)內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α的穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)線粒體氧化磷酸化轉(zhuǎn)向糖酵解來(lái)提供能量[8]。除了通過(guò)HIF-1α直接在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)糖酵解，mTOR可以通過(guò)表達(dá)依賴(lài)一氧化氮合酶iNOS(inducible nitric oxide synthase,iNOS)：抑制OXPHOS，產(chǎn)生NO：下調(diào)線粒體的功能[9]，使細(xì)胞在缺乏線粒體呼吸作用的情況下轉(zhuǎn)化為糖酵解代謝，間接調(diào)節(jié)TLR誘導(dǎo)炎性DC的糖酵解作用[10]。正如Everts等人[9]研究發(fā)現(xiàn)LPS刺激infDC后24 h內(nèi)，iNOS表達(dá)增加，內(nèi)源性NO生成增多，NO抑制線粒體內(nèi)電子傳遞鏈，并且5’腺苷一磷酸激活蛋白激酶(5’adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)途徑被抑制，從而抑制OXPHOS，糖酵解代謝增強(qiáng)。而為驗(yàn)證該通路，該小組應(yīng)用己糖激酶抑制劑：2-脫氧葡萄糖(2-deoxyglucose,2-DG)抑制糖酵解后，發(fā)現(xiàn)iNOS infDC的數(shù)目明顯減少，而其他DC亞群無(wú)明顯變化。Wei等人[11]研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用2-DG抑制DC糖酵解后促使了Th17細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)方向轉(zhuǎn)化。另有研究應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002后發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)的糖酵解顯著降低[12]。生長(zhǎng)因子受體如GM-CSF可以激活PI3K/Akt。當(dāng)GM-CSF用于未成熟的靜息狀態(tài)的DC細(xì)胞中時(shí)，Akt被活化。

3.2 TBK1/IKKε-AKT途徑 然而，DC細(xì)胞成熟早期所須的糖酵解代謝旁路并非在缺氧或無(wú)氧條件下發(fā)生的。近期研究表明，早期TLR誘導(dǎo)糖酵解支持DC激活的合成代謝需求并不依賴(lài)mTOR 或HIF-1α信號(hào)通路，而是取決于AKT。Everts等人[13]采用光譜-色譜分析法追蹤1,2-13C葡萄糖，從而證明了與對(duì)照組相比，當(dāng)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激BMDC 1 h后，葡萄糖更加迅速的將其碳源傳遞給了丙酮酸鹽和乳酸鹽，體外培養(yǎng)CD24+DC，以TLR刺激并觀察其細(xì)胞外酸化率(extracellular acidification rate,ECAR)快速增長(zhǎng)，這代表乳酸生成增多，糖分解代謝增加。氧耗率(oxygen consumption rate,OCR)和ECAR能夠分別用于評(píng)價(jià)線粒體呼吸作用和糖酵解[14]。研究揭示了以下代謝途徑：以LPS作用于DC后數(shù)分鐘內(nèi)，TLR被激活，通過(guò)其下游TANK結(jié)合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)/核因子-κB激酶ε亞基(nuclear factor-κB kinase subunit-ε,IKKε)，致Akt發(fā)生磷酸化，從而促進(jìn)糖酵解的限速酶之一：己糖激酶(hexokinase,HK)-Ⅱ與電壓依賴(lài)性陰離子通道結(jié)合，HK-Ⅱ易位至線粒體外膜，啟動(dòng)糖酵解，而快速增加的糖酵解最終生成檸檬酸鹽，通過(guò)slc25a1轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞液內(nèi)進(jìn)行脂肪酸合成。易位后，HK-Ⅱ可直接獲得高濃度的ATP，從而進(jìn)一步增強(qiáng)其酶活性。增加的糖酵解通過(guò)作為PPP和TCA循環(huán)的碳源支持來(lái)補(bǔ)充N(xiāo)ADPH和檸檬酸，促進(jìn)利用二者進(jìn)行脂肪酸的從頭合成。脂肪酸合成增加是為了提供內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體擴(kuò)張所需的膜結(jié)構(gòu)，以滿足DC對(duì)早期激活標(biāo)記物的翻譯、轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌以及分泌促炎細(xì)胞因子的需求。因此，TBK1/IKKε-AKT通路才是快速誘導(dǎo)有氧糖酵解的通路。與此一致的是：在透射電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)在被激活的DC中糖酵解迅速增強(qiáng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體以一種依賴(lài)脂肪酸從頭合成的方式在擴(kuò)大。被激活后，DC保持糖酵解這個(gè)過(guò)程對(duì)于持續(xù)其存活是必不可少的，并且通過(guò)mTOR和HIF-1α被控制[6]。而無(wú)論在體外還是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，抑制這一早期的代謝途徑改變將會(huì)抑制DC的激活、遷移、及T細(xì)胞激活[10]。這一過(guò)程可以被AMPK抑制，AMPK是脂肪酸β氧化的中樞調(diào)節(jié)器。

IKKε和TBK1是非經(jīng)典IKB激酶家族(IKB kinases,IKKs)的成員，二者結(jié)構(gòu)相似，N端為激酶區(qū)域，C端為NEMO結(jié)合域，此外，還包括羧基端的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)和螺旋-環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)。在經(jīng)典的核因子-κB (nuclear factor-κB,NF-κB)信號(hào)通路中，IKKε與TBK1形成異源二聚體，磷酸化并激活NF-κB和IFN調(diào)節(jié)因子(IRF)，導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子、趨化因子和Ⅰ型干擾素(type Ⅰ interferon,IFN Ⅰ)產(chǎn)生增加，促進(jìn)免疫應(yīng)答及炎性疾病的發(fā)生，因此又稱(chēng)為NF-κB的額外活化激酶[15]。IKKε/TBK1的活化依賴(lài)自身磷酸化和經(jīng)典IKK復(fù)合物介導(dǎo)途徑兩種方式激活，其中作用最強(qiáng)的炎性刺激因子為T(mén)LR3、TLR4、RIG-Ⅰ[16]。

4 調(diào)節(jié)DC代謝與免疫性疾病的治療

操縱細(xì)胞代謝以達(dá)到治療目的已經(jīng)不是一個(gè)新興的觀點(diǎn)了。在腫瘤領(lǐng)域，人們傾向于應(yīng)用藥理學(xué)方法抑制合成代謝或糖酵解來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)[17,18]。近年來(lái)，對(duì)于誘導(dǎo)離體DC產(chǎn)生免疫刺激性自體DC疫苗的研究成為了重點(diǎn)，其中一些疫苗已經(jīng)應(yīng)用于腫瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)性疾病等領(lǐng)域的臨床研究或疾病治療中。如：已有一項(xiàng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)開(kāi)始應(yīng)用tol-DC治療Ⅰ型糖尿病[19]；應(yīng)用地塞米松、維生素D3加載上滑液及自體DC治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[20]；聯(lián)合維生素D3通過(guò)增強(qiáng)CD4+CD25+抑制性T細(xì)胞治療牛皮癬[21]等。而其中前列腺癌DC疫苗作為第一個(gè)針對(duì)癌癥的DC疫苗，已經(jīng)被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市[22]。多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)是T細(xì)胞介導(dǎo)的，以白質(zhì)脫髓鞘、軸索損傷為主要病理特點(diǎn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎性疾病。在MS患者腦脊液循環(huán)中可檢測(cè)到分泌促炎因子的DC，此DC水平已經(jīng)成為了MS患者的一項(xiàng)臨床檢測(cè)指標(biāo)。除了通過(guò)對(duì)Th1/Th2細(xì)胞平衡的調(diào)節(jié)治療疾病，已有研究應(yīng)用tol-DC誘導(dǎo)復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化(relapsing-remitting multiple sclerosis，RRMS)患者體內(nèi)產(chǎn)生抗原特異性低反應(yīng)性T細(xì)胞[23]。目前，已有兩項(xiàng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)在臨床試驗(yàn)上登記，評(píng)估負(fù)載MS患者NCT02618902和NCT02903537髓鞘肽段的tol-DC的可行性與安全性[24]。

此外，地塞米松、維生素D3、雷帕霉素等多種藥物可以通過(guò)調(diào)節(jié)代謝途徑誘導(dǎo)DC向耐受性DC轉(zhuǎn)變[25]。白藜蘆醇通過(guò)激活組蛋白去乙?；?(histone deacetylase Sirtuin 1)，抑制HIF-1α功能，同時(shí)增強(qiáng)過(guò)氧化物酶增值活化受體協(xié)同刺激分子1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α,PGC-1α)的活性而增強(qiáng)分解代謝，促進(jìn)氧化磷酸化代謝，誘導(dǎo)耐受性DC[26]。羅格列酮可促進(jìn)線粒體生物合成、上調(diào)脂肪酸氧化、干擾TLR介導(dǎo)的DC活化[27]、誘導(dǎo)免疫耐受。實(shí)驗(yàn)證明，雷帕霉素作為絲/蘇氨酸蛋白酶抑制劑，可抑制mTOR，誘導(dǎo)tol-DC，減輕器官移植術(shù)后的排異反應(yīng)[28]。研究表明在TLR誘導(dǎo)激活的DC中直接抑制糖酵解可以下調(diào)Th1細(xì)胞表達(dá)，上調(diào)Foxp3+的輔助T淋巴細(xì)胞生成，從而促進(jìn)免疫耐受[13]。

5 前景展望

研究表明轉(zhuǎn)變代謝途徑在誘導(dǎo)DC表型和功能的改變中具有舉足輕重的作用，目前已有一些研究應(yīng)用DC疫苗、tol-DC治療自身免疫性疾病、改善移植后免疫排斥反應(yīng)等，但通過(guò)調(diào)節(jié)DC代謝途徑誘導(dǎo)免疫耐受還需要進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)及臨床研究，但隨著研究不斷深入，必將推動(dòng)自身免疫性疾病的治療不斷發(fā)展。