原發(fā)性肝癌局部治療與免疫相關(guān)動(dòng)物模型的選擇*

陳曉琦 陳欣菊 趙 晴 鄺玉慧 冀愛英

河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科 (河南 鄭州， 450003)

局部治療是一種微創(chuàng)治療方法，如熱消融或肝動(dòng)脈介入栓塞直接治療腫瘤。這些常用的治療原發(fā)性肝癌的方法不僅會(huì)導(dǎo)致肝癌細(xì)胞死亡，還會(huì)引發(fā)腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)。本文對(duì)局部治療與癌癥免疫學(xué)之間的聯(lián)系進(jìn)行綜述，并討論了動(dòng)物模型研究相關(guān)的問題，以促進(jìn)此領(lǐng)域的快速發(fā)展。

1 肝癌局部治療動(dòng)物模型的研究

動(dòng)物模型使實(shí)驗(yàn)性藥物和免疫調(diào)節(jié)劑的臨床前優(yōu)化先于人體試驗(yàn)。當(dāng)系統(tǒng)給藥時(shí)，具有潛在致命毒性的新藥物在動(dòng)脈內(nèi)或腫瘤內(nèi)局部給藥應(yīng)首先在臨床前進(jìn)行測(cè)試。在臨床前動(dòng)物的生存模型中，可以多方面對(duì)生物標(biāo)志物取樣，而且不需要擔(dān)心輻射暴露。

誘導(dǎo)小鼠腫瘤形成的方法有多種，包括基因工程、小鼠模型、趨化劑、肝內(nèi)或脾內(nèi)注射腫瘤細(xì)胞和腫瘤移植。此外，由于原發(fā)性肝癌(HCC)通常是在肝臟原有病變的情況下發(fā)生的，所以可以采用誘導(dǎo)小鼠肝臟疾病的方法來模擬病毒性肝炎、脂肪肝、肝纖維化、酒精引起的肝病和膽汁淤積[1]。此外，人性化小鼠可能具有潛在模仿人類免疫反應(yīng)的作用，然而這項(xiàng)技術(shù)是有挑戰(zhàn)性的，目前尚未被肝癌免疫治療領(lǐng)域采用。

研究者對(duì)肝癌免疫系統(tǒng)機(jī)制的了解大部分來自于小鼠模型實(shí)驗(yàn)。小鼠模型具有吞吐量?jī)?yōu)勢(shì)，可對(duì)大量動(dòng)物進(jìn)行處理，飼養(yǎng)簡(jiǎn)單，成本較低。然而,由于規(guī)模的差異，體型成為研究局部治療和藥物輸送的劣勢(shì)。研究人員對(duì)局部區(qū)域技術(shù)的建模和應(yīng)用的能力有限，所以皮下腫瘤的消融只能在相對(duì)小而圓的腫瘤上進(jìn)行，以防止皮膚燒傷和對(duì)周圍組織的損傷，且可能危及動(dòng)物的神經(jīng)。在小鼠和大鼠模型中，由于血管口徑小，動(dòng)脈內(nèi)給藥非常具有挑戰(zhàn)性。通路血管和肝內(nèi)靶向血管均小于標(biāo)準(zhǔn)臨床器械和侵入性成像設(shè)備。與人類或大型動(dòng)物血管相比，特定的微球大小可能有非常不同的生物效應(yīng)。此外，由于純粹的幾何形狀和比例，在小鼠模型中還缺乏用于實(shí)時(shí)指導(dǎo)動(dòng)脈內(nèi)治療過程的造影劑。用于人體的造影劑是非離子型和水溶性的，從小鼠血液中清除太快，不能在程序時(shí)間內(nèi)高分辨率成像，而靜脈超聲造影劑還不能滿足動(dòng)脈期信息的需要。

至少有3個(gè)動(dòng)物模型可以模擬局部治療，并用于研究介入腫瘤學(xué)對(duì)肝癌的影響。兔VX2模型已廣泛應(yīng)用于肝腫瘤的各種消融技術(shù)和動(dòng)脈內(nèi)給藥[2]。然而，該模型對(duì)免疫學(xué)研究有較大的局限性。首先，VX2是一種由乳頭狀瘤病毒誘導(dǎo)的野兔間變性鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系，在組織學(xué)和遺傳學(xué)上不像大多數(shù)人類HCC亞型[3]。細(xì)胞在供體動(dòng)物的肌肉中增殖，監(jiān)測(cè)腫瘤體積是否足夠，然后進(jìn)行腫瘤切除，切除壞死部分，僅將存活的腫瘤細(xì)胞移植到動(dòng)物體內(nèi)。這些VX2細(xì)胞可以移植到不同的位置，如側(cè)翼、肝臟、肺和腎臟。移植技術(shù)導(dǎo)致了該模型在免疫學(xué)研究中的第二個(gè)局限性，即移植兔與被移植兔的基因不相同。因此，腫瘤可以被認(rèn)為是同種異體移植，而不是自體移植物。受體動(dòng)物有可能將腫瘤細(xì)胞識(shí)別為非自身，并表達(dá)排斥或改變免疫反應(yīng)。第三，植入前去除壞死部分可能出現(xiàn)刪除抗原或干擾免疫應(yīng)答的反應(yīng)。最后，植入的VX2腫瘤不太可能再現(xiàn)人類HCC微環(huán)境。VX2肝腫瘤隨著周圍血管的增多而進(jìn)化和生長(zhǎng)，而中心區(qū)域可能由于供血不足或其他未知原因發(fā)育為中心型或異質(zhì)性壞死。這可能會(huì)阻礙抗原識(shí)別或呈現(xiàn)，隨后免疫細(xì)胞出現(xiàn)非過濾性壞死。這不僅會(huì)影響藥物療效和對(duì)安全性的研究，也會(huì)限制對(duì)局部或局部治療后免疫調(diào)節(jié)的認(rèn)識(shí)。與人類腫瘤不同，VX2腫瘤的異質(zhì)性有一定的局限性，免疫通路的激活或逃逸可能缺失、模型不完善或被忽視。

近年來，為了研究介入腫瘤學(xué)范式，引入了兩種HCC模型，即大鼠和土撥鼠，前者由毒素二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo)，后者由土撥鼠肝炎病毒誘導(dǎo)。這兩種模型和大多數(shù)人類腫瘤一樣，腫瘤是在肝臟疾病纖維化或慢性炎癥的背景下自發(fā)形成的。肝臟是一種對(duì)病原體、益生菌和食物源抗原具有耐受性和有效反應(yīng)的器官，考慮到肝臟的免疫學(xué)特性，原位模型可能優(yōu)于其他模型[4]。一項(xiàng)總結(jié)分析研究發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物模型中，致癌物誘導(dǎo)的腫瘤與臨床反應(yīng)之間存在生物相關(guān)性[5]。不同小鼠肝癌的表現(xiàn)已經(jīng)表明,腫瘤至少與人類疾病相似,而且發(fā)現(xiàn)人類肝細(xì)胞癌幾乎普遍攜帶Braf V637E突變。隨著粘附性和肥大性動(dòng)脈供血的發(fā)展，肝內(nèi)腫瘤的逐漸生長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致更好的建模，這種供血類似于人類HCC，并可能促進(jìn)與免疫系統(tǒng)之間的相互作用。土撥鼠肝癌模型可發(fā)展出大的、血管過度浸潤(rùn)并可選擇靶向治療的腫瘤，用于新療法和介入腫瘤學(xué)區(qū)域內(nèi)治療研究。該模型的腫瘤異質(zhì)性和遺傳變異有待進(jìn)一步研究，但可以為肝癌的新治療研究提供最新的模型。

2 細(xì)胞死亡和抗腫瘤免疫

細(xì)胞死亡如何影響腫瘤免疫已被學(xué)者廣泛研究。受細(xì)胞死亡影響的免疫機(jī)制主要有3種:腫瘤抗原、抗原遞呈細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞。臨床前研究增加了學(xué)者對(duì)免疫系統(tǒng)如何對(duì)局部治療和隨后的細(xì)胞死亡做出反應(yīng)的理解。眾所周知，細(xì)胞死亡的類型對(duì)抗腫瘤免疫有顯著影響。相關(guān)研究模型使用3個(gè)冷凍解凍循環(huán)(冷凍消融)或伽瑪輻照來殺死腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫，證明了細(xì)胞凋亡，而不是壞死的腫瘤細(xì)胞死亡。有趣的是，病原體相關(guān)的分子模式類似物，如p(dI-dc)和/或未甲基化的合成DNA能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，即使是對(duì)腫瘤細(xì)胞裂解物的應(yīng)答[6，7]。進(jìn)一步的分子研究表明，壞死的腫瘤細(xì)胞死亡不能誘導(dǎo)抗腫瘤免疫，這是由于凍融細(xì)胞中寡肽酶的活性所致[8]?？乖瓎?dòng)免疫應(yīng)答的存在和過程機(jī)制可能受細(xì)胞死亡或細(xì)胞損傷的類型、抗原提呈細(xì)胞的必要分子伴侶、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的供應(yīng)以及附近血管供應(yīng)鏈的鄰近性的控制。這種復(fù)雜的動(dòng)態(tài)分子交互過程很難用簡(jiǎn)單的線性因果描述規(guī)則來描述。動(dòng)物模型不能再現(xiàn)人類肝癌發(fā)生的藥理學(xué)免疫調(diào)節(jié)的復(fù)雜而動(dòng)態(tài)的免疫過程。

顯然，細(xì)胞在體內(nèi)死亡的情況更為復(fù)雜。有學(xué)者研究了化療誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的作用及其對(duì)腫瘤免疫的影響，認(rèn)為初始刺激可導(dǎo)致免疫原性或非免疫原性細(xì)胞死亡。免疫原性細(xì)胞死亡涉及釋放鈣網(wǎng)蛋白等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)在細(xì)胞表面,在起泡階段三磷酸腺苷分泌的細(xì)胞凋亡,細(xì)胞死亡率釋放非組蛋白的染色質(zhì)蛋白高移動(dòng)率組1 促進(jìn)補(bǔ)充和激活樹突狀細(xì)胞進(jìn)入腫瘤微環(huán)境,這將允許垂死的腫瘤細(xì)胞吞噬腫瘤抗原，并將最佳抗原呈現(xiàn)給T細(xì)胞。已知誘導(dǎo)和增強(qiáng)免疫原性細(xì)胞死亡的化療藥物包括阿霉素和奧沙利鉑，而順鉑不能誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡；阿霉素是肝細(xì)胞癌化療栓塞中最常用的藥物，其在肝細(xì)胞癌圖像引導(dǎo)區(qū)域治療中的應(yīng)用具有廣泛的意義[9，10]。

在實(shí)驗(yàn)小鼠模型中，細(xì)胞死亡的類型不僅決定了免疫效果，也決定了腫瘤的類型。最近研究顯示，凋亡相關(guān)的肝細(xì)胞因子微環(huán)境決定了肝癌是否從癌基因轉(zhuǎn)化的肝細(xì)胞中生長(zhǎng)出來，而含有相同致癌驅(qū)動(dòng)因子的肝細(xì)胞如果面臨壞死微環(huán)境，則會(huì)導(dǎo)致肝內(nèi)膽管癌(ICC)。抑制壞死的藥理學(xué)或遺傳學(xué)可逆轉(zhuǎn)壞死依賴的細(xì)胞因子微環(huán)境，并將ICC轉(zhuǎn)換為HCC[11]。

2003年，局部治療對(duì)抗腫瘤免疫作用的首批研究之一，報(bào)道了腫瘤特異性T細(xì)胞在VX2腫瘤模型兔射頻消融后活化。射頻和低溫消融已被證明可為體內(nèi)樹突狀細(xì)胞提供抗原來源。射頻消融術(shù)可增強(qiáng)體內(nèi)腫瘤特異性免疫應(yīng)答，使樹突狀細(xì)胞在射頻消融作用下浸潤(rùn)腫瘤，并可通過脾細(xì)胞轉(zhuǎn)移至幼稚小鼠體內(nèi)賦予免疫。這些機(jī)制主要通過上調(diào)抗原表達(dá)來發(fā)揮作用。熱消融(經(jīng)皮射頻消融、微波消融、冷凍消融和不可逆電穿孔)對(duì)免疫反應(yīng)的影響是頗有見解但有些推測(cè)性的綜述的主題[12，13]。

3 動(dòng)物模型中不同的免疫基礎(chǔ)方法與區(qū)域定位療法的結(jié)合

在動(dòng)物模型中可以評(píng)估不同的免疫基礎(chǔ)方法與區(qū)域定位療法的結(jié)合。使用一種定義明確的小鼠B16-OVA腫瘤模型，ctla4阻斷抗體是在此環(huán)境中測(cè)試的首批化合物之一。研究證明，它不僅對(duì)OVA有微弱但可檢測(cè)的免疫反應(yīng)，而且對(duì)更廣泛的B16抗原也有免疫反應(yīng)，這一效應(yīng)的意義在過繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中得到了證實(shí)。在過繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中，將RFA消融后小鼠脾細(xì)胞轉(zhuǎn)移到具有活腫瘤細(xì)胞的小鼠體內(nèi)?？筩tla治療時(shí)腫瘤破壞增強(qiáng)抗腫瘤免疫。在臨床前小鼠前列腺癌模型中也觀察到類似的結(jié)果?？筩tla4治療增強(qiáng)了冷凍消融的效果，導(dǎo)致繼發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)受損[14]。RFA和TLR9聯(lián)合刺激在VX2肝癌模型中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示聯(lián)合刺激可預(yù)防后續(xù)腫瘤擴(kuò)散。類似的結(jié)果已經(jīng)在B16-OVA模型聯(lián)合冷凍消融和通過CPG-低聚核苷酸刺激TLR9的聯(lián)合治療中獲得，由于樹突狀細(xì)胞成熟增強(qiáng)導(dǎo)致腫瘤小鼠更有效的交叉表達(dá)，該聯(lián)合治療在根除局部和全身腫瘤方面非常有效[15]。

光動(dòng)力療法(PDT)使用無毒光敏劑和無害可見光與氧氣結(jié)合產(chǎn)生細(xì)胞毒性活性氧，通過細(xì)胞凋亡和/或壞死選擇性殺傷惡性細(xì)胞，關(guān)閉腫瘤微血管，保留正常組織。它可引起急性炎癥反應(yīng)、休克和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，從而誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡。PDT已被證明可以防止遠(yuǎn)處未治療腫瘤的生長(zhǎng)，并以CD8+T細(xì)胞依賴性的方式防止小鼠腫瘤再挑戰(zhàn)?？筩tla4治療顯著提高了小鼠的治療效果和存活率[16]。與Toll樣受體-7激動(dòng)劑咪喹莫特 (R837)聯(lián)合使用聚乳酸-乙醇酸(PLGA)與光熱劑共囊包封時(shí)，也可觀察到類似的結(jié)果。聯(lián)合抗ctla4治療小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)可抑制轉(zhuǎn)移形成，導(dǎo)致腫瘤縮小。IL-2以融合蛋白的形式與腫瘤特異性抗體結(jié)合，被證明可以增強(qiáng)對(duì)經(jīng)射頻消融治療的結(jié)腸腫瘤的抗腫瘤免疫[17]。

不足量的射頻消融也被證明可以通過HIF-1a/VEGFA促進(jìn)殘余肝細(xì)胞癌的血管生成和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)。射頻消融還可以通過IL6、c-met或hgf依賴的途徑誘導(dǎo)肝再生和腫瘤發(fā)生[18]。盡管如此，單獨(dú)或聯(lián)合調(diào)節(jié)射頻加熱參數(shù)，輔以熱休克蛋白抑制、STAT3抑制或簡(jiǎn)單的環(huán)氧化酶-2選擇性非甾體抗炎藥物可以減輕或減少不必要的、非靶向的全身致瘤作用[19]。然而，在部分消融或栓塞誘導(dǎo)致瘤反應(yīng)與免疫退行性之間，可能存在著一種不穩(wěn)定且難以理解的平衡。通過藥物調(diào)節(jié)打破這種平衡可能會(huì)更充分地了解HCC。