豬精液冷凍關(guān)鍵技術(shù)的研究與分析

龍清孟，毛世明，周 迪，陳光侯，龔 菲，李 平，李 俊，朱寬峰，金穗華

[1.貴州省種畜禽種質(zhì)測(cè)定中心，貴州 貴陽(yáng) 550018；2.北京田園奧瑞生物科技有限公司，北京 海淀 100089；3.農(nóng)業(yè)部牛冷凍精液質(zhì)量檢測(cè)中心（南京），江蘇 南京 210095]

近年來(lái)，使用豬的原精，經(jīng)過(guò)稀釋處理，開(kāi)展人工授精配種技術(shù)，在養(yǎng)豬業(yè)中得到廣泛推廣應(yīng)用，這一技術(shù)具有自然交配不可比擬的優(yōu)點(diǎn)：1）可以提高良種公豬利用率，加速品種改良；2）解決了豬場(chǎng)存在一定程度母豬自然交配的困擾：如公、母豬體格相差太大，母豬不堪負(fù)重；3）解決了某些地方品種的母豬生殖道本身的生理特征不利于自然交配，精液容易倒流等問(wèn)題；4）可擴(kuò)大優(yōu)秀公豬在時(shí)間和地域上的利用率，為優(yōu)秀種豬精液的資源共享提供便利條件，尤其適用地勢(shì)險(xiǎn)要的貴州農(nóng)村山區(qū)，村寨之間、鄉(xiāng)鎮(zhèn)之間由于交通不便，不便于趕公豬開(kāi)展自然交配；5）人工授精還可以有效防止公、母豬受到多種疫病接觸傳染的可能。然而采用豬的常溫精液（原精稀釋處理）輸配，在一定程度上受到時(shí)間、空間距離的限制，常溫精液保存期一般在3～5 d，常溫精液不便于長(zhǎng)途運(yùn)輸及途中控溫等缺點(diǎn)，無(wú)法充分發(fā)揮場(chǎng)與場(chǎng)之間優(yōu)秀種公豬精液的資源共享，因此，目前豬人工授精技術(shù)在養(yǎng)豬生產(chǎn)實(shí)踐中，已經(jīng)從采用常溫精液輸配技術(shù)，逐漸轉(zhuǎn)移到凍精制作和凍精解凍輸配技術(shù)上。

現(xiàn)階段，豬精液的冷凍制作及保存關(guān)鍵技術(shù)研究受到了全球養(yǎng)豬業(yè)重視和關(guān)注，我國(guó)豬冷凍精液的研究雖然在技術(shù)上已經(jīng)取得了一定的突破，但是也有很多研究報(bào)道了豬的冷凍精液制作在技術(shù)上還有待進(jìn)一步完善[1]。由于豬精子的生物學(xué)特性，其精液冷凍制作技術(shù)要求不完全與牛、羊的冷凍精液制作技術(shù)相同，主要是豬精子在冷凍、解凍過(guò)程中更容易受到損傷。因此，深入系統(tǒng)地研究豬精液冷凍機(jī)理和生產(chǎn)過(guò)程的關(guān)鍵技術(shù)，探討影響豬凍精活力及受精能力的因素，進(jìn)一步改進(jìn)豬精液冷凍技術(shù)及操作方法，已成為國(guó)內(nèi)外種豬育種生產(chǎn)中渴望解決的急迫問(wèn)題[2]。目前，國(guó)內(nèi)豬精液冷凍工藝流程基本相同，只是在關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)的具體操作方面各有差異。本研究就目前國(guó)內(nèi)現(xiàn)狀，提出有關(guān)豬精液冷凍的一些關(guān)鍵技術(shù)要點(diǎn)與質(zhì)量控制等六方面的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)的見(jiàn)解，以供同行參考。

1 嚴(yán)把原精（新鮮精液）質(zhì)量關(guān)

豬冷凍精液質(zhì)量的好壞除了受冷凍技術(shù)的影響外，還與原精質(zhì)量密切相關(guān)。較多的試驗(yàn)證明，不是每頭公豬的原精液或是每一次采集的精液所制作出的凍精，都可以保證得到滿意的冷凍效果。按照精液冷凍工藝要求，對(duì)于采精公豬（品種、年齡和個(gè)體間存在差異）或采集的精液（質(zhì)量評(píng)估）是具有一定的選擇性，選擇強(qiáng)度要求視所在地區(qū)的基礎(chǔ)統(tǒng)計(jì)確定，通常對(duì)于老齡公豬、精液不耐凍的公豬不列為制作凍精對(duì)象。其次，精液采集技術(shù)是關(guān)鍵，精液采集過(guò)程中如果采精員不按標(biāo)準(zhǔn)操作要求（采集前清潔衛(wèi)生、采集保留中段精液，前段及后段精液棄掉），可對(duì)原精質(zhì)量帶來(lái)不利影響，直接影響后續(xù)的凍精制作質(zhì)量，因此，這就要求采精人員的操作熟練、規(guī)范，使公豬能夠得到充分射精，并把握好精液采集過(guò)程，棄去最初（近20%、少精子）和最后（可達(dá)40%、膠狀凝塊為主）的無(wú)用精液[3]。原精品質(zhì)檢測(cè)：要求外觀色澤正常乳白色，稍微帶一點(diǎn)腥味，無(wú)臭味，不允許有膿性分泌物及其他臟污，檢測(cè)精子密度≥2億/mL，活率≥90%，活力≥80%，畸形率≤10%。豬原精品質(zhì)好與否是直接影響凍精制作成功與否的決定性因素，因此豬凍精的前提，必須嚴(yán)把原精源頭質(zhì)量關(guān)。

2 稀釋液

稀釋液不僅是作為擴(kuò)大精液量的填充成分，更重要的是可對(duì)稀釋后精子發(fā)揮保護(hù)作用。通常，稀釋液的主要成分均是按照精液（精子）的生物、物理學(xué)特性與需要來(lái)配制，各畜種間存在差異。

2.1 糖類

以馬和豬的精液來(lái)說(shuō)，其稀釋液補(bǔ)充糖類似乎較牛、羊的精液更為重要[4]。目前認(rèn)為就種畜精液常用的保存液中添加糖類主要有：乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等，普遍認(rèn)為以果糖為佳[5-6]，實(shí)際生產(chǎn)中因果糖價(jià)格的昂貴，多數(shù)仍以使用蔗糖、葡萄糖為主，有的使用果糖只是作為適量添加。李震鐘等[7]研究表明，在豬凍精稀釋液中，添加2%～4%葡萄糖效果較好，濃度過(guò)高對(duì)精子的頂體有損害作用；Paulenz等[8]研究發(fā)現(xiàn)添加乳糖的效果比蔗糖和果糖好；李青旺等[9]低濃度的葡萄糖（2%～3%）與乳糖（2%～3%）混合使用效果很好；0.05%可溶解性氮-乙酰-D-氨基葡萄糖的稀釋液冷凍豬精液，能夠顯著提高凍精解凍后的精液活力和頂體完整性[10]。

2.2 緩沖物質(zhì)、非電解質(zhì)

Tris（三羥甲基氨基甲烷）不僅與檸檬酸鹽、磷酸鹽作為常用的緩沖劑保持精液適當(dāng)?shù)膒H，并且對(duì)于精液的冷凍具有良好作用，很多養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家在制作豬的凍精時(shí)，使用的冷凍稀釋液中都含有 Tris[7]；OEP（Orvus Es Past）是一種含有十二烷基硫酸鈉（SDS）的復(fù)合物，適宜濃度的OEP能夠顯著提高豬凍精解凍后的精子活力和頂體完整性（P＜0.05）[11-14]。在稀釋液中添加適量合成洗滌劑Tris、OEP（Orvus Es Past/Equex Stm）、CNB（安鈉咖）等，對(duì)解凍后的精子活力、活率、質(zhì)膜與頂體的完整性和存活時(shí)間等有不同程度的保護(hù)作用[10]。研究資料表明，副性腺體分泌物的電離度，比附睪精液可能高10倍，這樣常常會(huì)使豬精子在短時(shí)間內(nèi)失掉電荷而發(fā)生凝集現(xiàn)象[4]。為此，在精液稀釋液中加入非電解質(zhì)物質(zhì)以緩和副性腺體分泌物的電離程度，常用的非電解質(zhì)物質(zhì)除各種糖類外，甘氨酸作為一種極弱的電解質(zhì)對(duì)豬的精液稀釋過(guò)程中有良好作用[4]。

2.3 防凍害保護(hù)劑

卵黃對(duì)精子的保護(hù)作用，是其所含脂蛋白、卵磷脂類物質(zhì)可以防止遭受精子冷休克。卵黃中的膽固醇與精子的存活力有關(guān)，有助于精子的存活[15]。不僅如此，卵黃的作用如同獨(dú)特的滲透緩沖器作用一樣，存在時(shí)可大幅減少高滲性的糖和鹽溶液對(duì)精子的有害影響[16]。卵黃應(yīng)來(lái)源于健康雞場(chǎng)的新鮮雞蛋，稀釋液中添加量一般控制在10%～20%之間為宜，加入后應(yīng)進(jìn)行充分混勻。特別提醒，在有氧條件下，卵黃中某些氨基酸經(jīng)酶系統(tǒng)的作用后，可能產(chǎn)生對(duì)精子有害的過(guò)氧化氫，因此，稀釋液必須強(qiáng)調(diào)是現(xiàn)配現(xiàn)用。

不可否認(rèn)，甘油仍是目前家畜精液冷凍的首選抗凍劑，甘油所具有的理化特性，可以保護(hù)和減緩精子在冷凍、解凍過(guò)程中越過(guò)冰晶危險(xiǎn)區(qū)域（0～-60℃）易受到傷害。不同畜種的精液，在稀釋后所需的最終甘油濃度有所不同。目前豬凍精制作中，大多數(shù)研究使用甘油的濃度在3%左右，姜興剛等在豬精子冷凍技術(shù)研究中表明：甘油濃度為2%或4%時(shí)，平衡60 min冷凍復(fù)蘇后精子活力最高[17]。甘油在精液冷凍過(guò)程中對(duì)精子既有保護(hù)的一面，甘油（Glycerol）為滲透性冷凍保護(hù)劑，在溶液中容易結(jié)合水分子，發(fā)生水合作用，使得溶液的黏性增加，降低了冷凍時(shí)水的結(jié)晶過(guò)程，從而達(dá)到保護(hù)精子的作用；又有毒害的一面，甘油對(duì)精子頂體有嚴(yán)重?fù)p害，會(huì)對(duì)精子細(xì)胞膜造成傷害[18-19]，甘油對(duì)精子具有濃度依賴性毒性，這種毒害的發(fā)生機(jī)理究竟是什么，至今解釋仍不夠清晰。但有一點(diǎn)是清楚的，甘油的添加可引起稀釋液滲透壓的升高[20]，從而造成精子細(xì)胞的蛋白質(zhì)變性，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損傷，形成對(duì)精子的損傷。有學(xué)者稱這種現(xiàn)象為“滲透損傷”[21]。最終甘油濃度發(fā)生變化引起滲透壓的變化，影響了精液凍后活力和Ⅰ類頂體完整率[22]?；诠i精子的生物學(xué)特性，在精液冷凍關(guān)鍵技術(shù)上，應(yīng)采取繼續(xù)降低甘油濃度。Polge（1976）之所以在532頭青年母豬中獲得75%受胎率，只是很簡(jiǎn)單的用了葡萄糖-卵黃液，著重抓了3個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)：一是低甘油（1%），二是快速冷凍，三是快速解凍[23]。

2.4 其他添加成分

金穗華等的試驗(yàn)證明，在牛冷凍精液解凍液中添加了咖啡因，在37℃環(huán)境溫度保存，經(jīng)檢測(cè)，結(jié)果頂體完整率試驗(yàn)組均高于對(duì)照組（P＜0.01），生存指數(shù)雖然高于對(duì)照組但差異不顯著[24]。豬冷凍精液稀釋液中添加咖啡因，精子活力試驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），頂體完整率試驗(yàn)組同樣顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）[25]，顯然，適量的咖啡因?qū)τ诰拥纳砘顒?dòng)具有一定的影響，但在實(shí)際輸精配種過(guò)程中，添加了咖啡因的精液受精的效果還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。當(dāng)然，不排除有的添加咖啡因是出于商業(yè)目的。

稀釋液中可以添加乙二胺四乙酸（EDTA）類的保護(hù)劑，尤其在凍精制作過(guò)程中，一定程度上起到了保護(hù)精子抗冷休克作用。

此外，在精液中添加激素，主要是為了使母畜機(jī)體發(fā)生有利于受精作用的變化。鑒于催產(chǎn)素能引起子宮平滑肌收縮，世文等[26]、徐美芳等[27]及羅旭芳等[28]曾在精液內(nèi)加入催產(chǎn)素，結(jié)果提高了受胎效果。前列腺素（Prostaglandin,PGs）也具有刺激平滑肌收縮的作用。使用同批號(hào)牛冷凍精液，在解凍液中添加了前列腺素 F2α（prostaglandin F2α，簡(jiǎn)寫 PGF2α）的配種試驗(yàn)，結(jié)果試驗(yàn)組（n=96）的受精率顯著高于對(duì)照組（n=120）20.8%（P＜0.01）。從理論上分析，前列腺素可引起子宮的收縮，有利于精子的運(yùn)行。而且可能刺激卵泡壁基底部的平滑肌收縮，導(dǎo)致卵泡壁破裂，卵子釋放[29]。

2.5 稀釋液的配制

稀釋液配制過(guò)程中，使用的試劑要求是分析純，使用時(shí)應(yīng)精準(zhǔn)稱量，配制用水為雙重蒸餾水或超純水，甘油在低溫黏稠情況下采取水浴加溫變稀，以便取量準(zhǔn)確，并可用適量稀釋液反復(fù)沖洗盛甘油容器，避免粘留，保證準(zhǔn)確添加量?？咕噩F(xiàn)配現(xiàn)加，每一類稀釋液配制完成后分別貼上醒目的文字標(biāo)簽。此外，為確保稱量天平的準(zhǔn)確性，要求稱量天平應(yīng)在檢定周期內(nèi)，天平應(yīng)定期檢定。

使用商品稀釋劑的應(yīng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書的要求配制稀釋液，過(guò)期或出現(xiàn)潮解、變色的不能使用。

3 溫度影響的關(guān)鍵環(huán)節(jié)

與牛比較，豬精子對(duì)于溫度的變化特別敏感。降溫過(guò)程中會(huì)使精子遭到冷休克影響，導(dǎo)致精子的某些生理變化，并與精子活力和受精力有相關(guān)聯(lián)系[3]。為了避免這樣的溫度打擊，不僅需要稀釋液中添加應(yīng)有的各類保護(hù)成分，同時(shí)還應(yīng)注意到稀釋溫度與降溫的速率。

3.1 涉及溫度的主要環(huán)節(jié)

豬精液冷凍工藝流程中基本上有11個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)涉及到溫度條件：原精液活力檢測(cè)→原精液稀釋自然降至室溫→轉(zhuǎn)入恒溫箱（17℃）中恒溫保存→17℃環(huán)境條件離心→棄上清液、等溫添加無(wú)甘油稀釋液→置低溫柜（3～5℃）降溫、平衡→平衡溫度下添加含甘油稀釋液→平衡溫度下封裝細(xì)管精液→置入冷凍程序儀器進(jìn)行精液冷凍→細(xì)管凍精分裝保存→細(xì)管凍精解凍→解凍后精子活率質(zhì)量檢測(cè)分析。

3.2 技術(shù)要點(diǎn)

3.2.1 活力檢測(cè) 涉及到精液活力的檢測(cè)，顯微鏡載物臺(tái)的溫度應(yīng)控制在37～38℃環(huán)境條件下，載玻片、蓋玻片也應(yīng)預(yù)先加溫。往往因?yàn)闇囟容^低影響精子前向運(yùn)動(dòng)的速率，導(dǎo)致活力評(píng)估失準(zhǔn)，影響后續(xù)工作質(zhì)量。

3.2.2 精液稀釋 涉及到添加稀釋液的應(yīng)采用等溫稀釋，根據(jù)精液溫度調(diào)節(jié)稀釋液溫度，不得反向操作，精液與稀釋液溫差不得超過(guò)1℃，加液量要準(zhǔn)確，添加時(shí)要沿管（杯）壁緩慢加入，并輕輕沿一個(gè)方向搖動(dòng)，混合均勻。使用前，稀釋液可以提前放置在恒溫水浴箱中預(yù)熱。

3.2.3 降溫、平衡 涉及到降溫的均應(yīng)按照工藝規(guī)定的控制時(shí)間，采取水浴方式可以減緩降溫速度。應(yīng)用時(shí)可按照大約每2～3 min下降1℃[3]。如果需要適當(dāng)提高降溫速率，可采用在水浴中添加冰塊的方法加速降溫。平衡時(shí)，低溫柜中的溫度必須穩(wěn)定在3～5℃。按工藝流程已實(shí)施降溫處理的精液，一定杜絕精液出現(xiàn)溫度回升，哪怕是短暫的回溫時(shí)間也決不允許。

3.2.4 封裝、冷凍 封裝也有稱灌裝，目前多使用細(xì)管分裝一體機(jī)，一次完成細(xì)管分裝、封口和印刷標(biāo)志的一體化操作。通常，封裝是在平衡低溫柜中進(jìn)行，該期間環(huán)境溫度仍應(yīng)保持在3～5℃，不得回升。封裝后的細(xì)管精液需要放置在同溫度條件（3～5℃）的托架上，其碼放的方向，棉塞端靠近操作者，超聲波封口端遠(yuǎn)離操作者，放入冷凍箱時(shí)同樣如此放置。冷凍箱提前預(yù)冷至同等溫度（3～5℃），程序冷凍儀擺放盡量靠近平衡低溫柜，上架后的細(xì)管精液從平衡柜轉(zhuǎn)移至程序冷凍儀的操作務(wù)必迅速，減少精液在空中暴露時(shí)間，及時(shí)關(guān)閉程序冷凍儀的箱蓋，然后用程序冷凍儀進(jìn)行冷凍。參考冷凍曲線4℃至1℃降溫速率1.5℃/min，1℃至-140℃降溫速率30℃/min，-140℃維持約5 min，然后取出精液浸入液氮。

冷凍儀是由電子計(jì)算機(jī)控制的全自動(dòng)冷凍設(shè)備，可根據(jù)試驗(yàn)研究的需要，設(shè)計(jì)并獲取多條冷凍溫度曲線。使用時(shí)首先選擇電腦中設(shè)置的豬精液冷凍最佳溫度曲線，精液冷凍和解凍過(guò)程的溫度原則上是快速通過(guò)冰晶危險(xiǎn)區(qū)域（0～-60℃），精液冷凍溫度控制在-140℃左右，初凍溫度調(diào)節(jié)至4℃，控制2 min降至1℃，控制4.7 min內(nèi)降至-140℃，并在超低溫-140℃維持約5 min，冷凍全過(guò)程應(yīng)在10～12 min之內(nèi)完成。冷凍完成后，迅速打開(kāi)冷凍儀的箱蓋，迅速將冷凍箱連同細(xì)管凍精一起浸沒(méi)在首先已經(jīng)盛滿液氮的泡沫箱中，然后在泡沫箱的液氮界面下，將細(xì)管凍精分裝入布袋或拇指管（注意在液氮界面下操作），分裝完畢后，并迅速轉(zhuǎn)移到液氮罐提筒中保存，注意完全浸泡在液氮面下。提醒：在裝入布袋或拇指管時(shí)，注意將細(xì)管凍精的超聲波封口端向上，棉塞封口端向下，不得倒置（以避免細(xì)管棉塞端的爆脫）。

3.2.5 凍精解凍質(zhì)檢，稀釋輸配

（1）每頭豬的凍精細(xì)管中取1支進(jìn)行解凍，采用50℃水浴解凍15～16 s后取出，用吸水紙或紗布擦干水珠，再用剪刀剪去細(xì)管兩端將精液移至10～15 mL的離心管中，按照10倍稀釋量，加入解凍液（預(yù)先在30℃的水浴鍋預(yù)熱），將解凍液稀釋好的精液置于30℃的水浴鍋10 min，從離心管中吸取4 μL在CASA全自動(dòng)精子質(zhì)量分析儀上進(jìn)行檢測(cè)分析。

（2）豬冷凍精液解凍輸配技術(shù)操作方法。①準(zhǔn)備好輸精瓶。②根據(jù)輸配量（母豬頭數(shù)）配置解凍稀釋液約40 mL/頭。③將配置好的解凍稀釋液放入30℃水浴鍋中預(yù)熱，約10 min。④待解凍稀釋液預(yù)熱好后，將豬冷凍精液取出放入50℃水浴鍋中解凍，15 s。⑤將解凍好的豬精液分裝入輸精瓶中，約8～10支細(xì)管/瓶，0.5 mL/細(xì)管。⑥將預(yù)熱好的解凍稀釋液分裝入輸精瓶中，約40 mL/瓶。⑦混勻后30℃孵育20 min后進(jìn)行輸配。

3.3 溫控設(shè)備

凡是涉及到溫度參數(shù)的儀器設(shè)備，應(yīng)定期進(jìn)行檢定或校準(zhǔn)，確認(rèn)其已滿足溫度控制的使用要求。必要時(shí)可使用檢定合格的溫度計(jì)隨機(jī)監(jiān)控。

4 精液離心

離心目的不僅是因?yàn)楣i精液量大而精子密度不高，需要縮小體積，有利于精液冷凍保存；而且可以除去精清，精清中存在危害精子的因素，影響精液冷凍和解凍效果。這在馬、豬、山羊、狗的精液研究中已被發(fā)現(xiàn)[30]。因此，離心已是精液冷凍過(guò)程中一項(xiàng)通用的技術(shù)要求。精液離心的關(guān)鍵技術(shù)要點(diǎn)是對(duì)離心轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間的把握。轉(zhuǎn)速過(guò)高或離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)精子有傷害，Salamon（1973）研究豬精液發(fā)現(xiàn)，用1 000 r/min離心10 min，對(duì)冷凍后活率有不良影響[19]。為避免和減小離心可能造成對(duì)精細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的滲出，轉(zhuǎn)速與離心時(shí)間的選擇應(yīng)以實(shí)際離心效果作為參考，筆者不建議離心后精子集中在離心管底部呈塊狀的效果，此現(xiàn)象一方面不利于精子的轉(zhuǎn)移，同時(shí)加大精子轉(zhuǎn)移撞擊損傷。對(duì)于離心時(shí)環(huán)境溫度的選擇，各家雖有不同，但必須注意到離心環(huán)境溫度與精液溫度的一致性。

5 精液凍前的降溫、平衡

平衡是指稀釋后的精液放置在低溫下經(jīng)歷一定的時(shí)間。平衡這一步驟是Polge在研究公牛精液冷凍方法時(shí)最先提出的，平衡溫度在歐美國(guó)家通常為4～5℃[30]。平衡的機(jī)制至今尚不清楚，平衡通常是指甘油的作用。甘油平衡的必要性，是以冷凍方法和動(dòng)物種類不同而異。豬精液冷凍降溫時(shí)間控制在2～3 h，平衡時(shí)間不少于1.5～2 h。目前的研究認(rèn)為，甘油滲透到精子體內(nèi)需要的平衡實(shí)際很快，甘油同精子接觸5 s至15 min，已能夠?qū)赢a(chǎn)生足夠的保護(hù)作用[31]。Blackshaw認(rèn)為，采用這一步驟還可能與細(xì)胞的離子平衡的變化有關(guān)，精子在稀釋后重建離子的平衡可能需要一定的時(shí)間[30]。有較多報(bào)道認(rèn)為，延長(zhǎng)5℃平衡時(shí)間明顯提高抗低溫打擊。

精液在達(dá)到平衡溫度的同時(shí)，還有一個(gè)逐步降溫（適應(yīng)）過(guò)程。嚴(yán)格地說(shuō)，是應(yīng)將降溫和平衡的時(shí)間分開(kāi)，不適合籠統(tǒng)叫平衡時(shí)間。目前采用一次稀釋法（含甘油）的，無(wú)法區(qū)分降溫和平衡的時(shí)間，只能統(tǒng)稱平衡時(shí)間或降溫平衡時(shí)間。二次稀釋法，先加無(wú)甘油的稀釋液，降溫至4～5℃再加含甘油的稀釋液作平衡，即可分清降溫和平衡的時(shí)間。

豬精液冷凍一般多采用二步稀釋法，對(duì)離心后精液先用不含甘油的預(yù)稀釋液稀釋，后待溫度慢慢降至平衡溫度條件下再加入含甘油的稀釋液[32]。因?yàn)?，?jīng)過(guò)降溫、平衡，在精子已處于半休眠狀態(tài)時(shí)，緩緩加入含甘油稀釋液，這樣高滲的稀釋打擊，對(duì)精子的傷害相對(duì)要小一些[33]。在低溫平衡的條件下，輕輕擺動(dòng)平衡的精液，同時(shí)，采用滴加的方式緩慢的添加甘油稀釋液，這樣操作似乎更符合上述理論的解釋，也許又是一項(xiàng)新的突破。

6 精液冷凍生產(chǎn)過(guò)程的質(zhì)量控制

6.1 質(zhì)量的不穩(wěn)定性

活力在0.7級(jí)以上的豬原精液，過(guò)濾后采用3步稀釋法制成冷凍精液，解凍活力在0.3級(jí)以上[34]。胡建洪試驗(yàn)，凍后精子活率達(dá)到0.513，精子頂體完整率達(dá)75.3%，質(zhì)膜完整精子達(dá)51.3%[35]。在批量生產(chǎn)的情況下，活力達(dá)到80%以上[2]。上述類似報(bào)道較多，精液凍后結(jié)果不盡一致，質(zhì)量差異明顯，并帶有一定的普遍性。由此可見(jiàn)，這樣的凍精質(zhì)量水平就一個(gè)區(qū)域性來(lái)評(píng)價(jià)，完全是處于一種不穩(wěn)定的狀態(tài)。豬冷凍精液作為一種特殊的生物產(chǎn)品，其質(zhì)量影響因素諸多，質(zhì)量極易出現(xiàn)波動(dòng)，精液冷凍過(guò)程中任何一個(gè)關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)上的失誤可導(dǎo)致全過(guò)程的失敗。這已引起相關(guān)技術(shù)人員的關(guān)注。為確保豬的精液凍后質(zhì)量始終處于受控狀態(tài)，應(yīng)不定期的對(duì)精液質(zhì)量性狀進(jìn)行評(píng)估和追溯分析，及時(shí)發(fā)現(xiàn)可能影響因素，及時(shí)采取相應(yīng)改進(jìn)與控制措施。

6.2 生產(chǎn)工藝的改進(jìn)與規(guī)范

豬冷凍精液目前需要解決的是改良精液的冷凍和解凍等操作過(guò)程對(duì)精子細(xì)胞質(zhì)膜和精子活力等造成的不利影響[1]。以目前現(xiàn)狀，為了保證冷凍精液產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定與可控，不僅對(duì)于該產(chǎn)品生產(chǎn)流程的每一個(gè)環(huán)節(jié)、每一個(gè)步驟，均應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序。而且應(yīng)該繼續(xù)對(duì)凍精生產(chǎn)工藝的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化組合[36]，其技術(shù)要點(diǎn)與質(zhì)量控制將是今后實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的重要基礎(chǔ)。需要盡快出臺(tái)具有較強(qiáng)的科學(xué)性和可操作性的豬冷凍精液技術(shù)規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)，這將有利于該產(chǎn)品質(zhì)量的提高和推廣。