胃癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測研究進(jìn)展

王 猛，李 晨，顧萍萍，譚 琳，劉 霞，周永坤

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）被認(rèn)為是從腫瘤原發(fā)部位和轉(zhuǎn)移部位進(jìn)入血液循環(huán)的各種類型的腫瘤細(xì)胞。早在1869年，澳大利亞醫(yī)生Ashwonh等在癌癥患者外周血中發(fā)現(xiàn)并首次提到了CTCs的概念[1]。CTCs具有癌癥干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）的特征，有很強(qiáng)的自我更新、分化能力，并且有致瘤能力和轉(zhuǎn)移能力等特征。早期的觀念認(rèn)為，當(dāng)腫瘤惡化或進(jìn)展時(shí)會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移，但越來越多的證據(jù)表明腫瘤的擴(kuò)散可能在早期發(fā)生。在原發(fā)腫瘤形成之前甚至可能發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]。CTCs被認(rèn)為是致腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的主要原因。檢測外周血中的CTCs方便無創(chuàng)、敏感度高，具有可重復(fù)檢測性，美國 FDA 認(rèn)證該檢測為目前最可觀的檢測手段之一。CTCs可以比影像診斷更早地預(yù)測腫瘤細(xì)胞的微轉(zhuǎn)移，然后指導(dǎo)腫瘤的早期診斷。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，CTCs的研究越來越深入，已成為目前研究的熱門內(nèi)容。胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，CTCs 檢測技術(shù)對(duì)胃癌的早期診斷和早期治療具有重要的意義。本文將總結(jié)近年來CTCs 的檢測技術(shù)，探討其在胃癌診治中的應(yīng)用價(jià)值。

1 CTCs的檢測

CTCs檢測被稱為“液體活檢”，能夠減少侵入組織取樣需求的機(jī)會(huì)。在腫瘤治療的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用方面具有很大的潛力；在腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后的作用受到越來越多的關(guān)注。由于腫瘤患者外周血中CTCs的數(shù)量非常少，濃度通常僅為1～10個(gè)/10 mL[3]，這要求檢測人員在短時(shí)間內(nèi)采用高靈敏度和特異性的檢測方法。目前CTCs富集方法包括根據(jù)物理性質(zhì)、免疫學(xué)原理和微流體裝置等。不同類型腫瘤的CTCs具有相對(duì)類似的物理學(xué)特征(如密度、電荷、大小和可變形性)和表面標(biāo)記，這些特征與血細(xì)胞不同[4]。

1.1 Cell Search系統(tǒng)檢測技術(shù) Cell Search系統(tǒng)檢測是將免疫熒光標(biāo)記與免疫磁珠分選富集技術(shù)相結(jié)合，是世界上比較先進(jìn)的檢測技術(shù)。具有靈敏度高，可重復(fù)性強(qiáng)，有特異性和自動(dòng)化程度較高等特點(diǎn)[5]。使用Cell Search系統(tǒng)從外周血檢測到的CTCs對(duì)預(yù)后的評(píng)估具有重要的參考價(jià)值，還可能預(yù)測胃癌患者對(duì)化學(xué)療法的不良反應(yīng)[6]。

1.2 楔形微流體芯片檢測技術(shù) 楔形微流體芯片（名為CTC-ΔChip）用三色免疫細(xì)胞化學(xué)方法（CK+/CD45-/Nucleus+）鑒定標(biāo)記CTCs，在癌癥患者血液樣本量較少的情況下，也能檢測到CTCs，在胃癌患者的診治中具有重要的臨床意義。CTC-ΔChip具有低成本，大批量生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)，在未來指導(dǎo)癌癥治療和預(yù)后監(jiān)測中具有很大的臨床應(yīng)用潛力[7]。

1.3 基于腫瘤選擇性復(fù)制單純皰疹病毒的技術(shù) 基于腫瘤選擇性復(fù)制單純皰疹病毒的技術(shù)，是根據(jù)端粒酶特異性，來復(fù)制選擇性溶瘤性皰疹病毒-1，使靶向端粒酶-逆轉(zhuǎn)錄酶陽性癌細(xì)胞能表達(dá)綠色熒光蛋白，借此來鑒定CTCs。與Cell Search相比，該試驗(yàn)在40例非小細(xì)胞肺癌患者中具有較高的陽性率[8]。

1.4 針狀細(xì)胞傳感器檢測技術(shù) 針狀細(xì)胞傳感器檢測技術(shù)，直接在血液中檢測和捕獲CTCs，而不改變遺傳信息，允許血液的整個(gè)循環(huán)通過細(xì)胞傳感器。本檢查方法靈敏度高，檢測CTCs的能力可達(dá)102～106個(gè)細(xì)胞/ mL，還能避免細(xì)胞信息的扭曲[9]。

1.5 陰性富集和免疫染色-FISH檢測技術(shù) Li等[10]使用陰性富集和免疫染色-FISH提高循環(huán)腫瘤細(xì)胞的敏感性和特異性，結(jié)合負(fù)濃縮、免疫細(xì)胞化學(xué)CD45染色和熒光原位雜交來鑒定、表征CTCs。肺癌、胃癌、乳腺癌和食管癌的陽性率分別為71.33%、86.21%、76.77%和78.35%。此外，CTCs可在Ⅰ期檢出，肺癌陽性率為64.15%，胃癌陽性率為83.33%，乳腺癌陽性率為78.95%，食管癌陽性率為68.18%，可促進(jìn)早期診斷，影響治療決策。

1.6 微流控芯片檢測技術(shù) 微流控芯片技術(shù)具有低成本、速度快、高通量、操作簡單的優(yōu)點(diǎn)。微流控芯片技術(shù)集成了樣本預(yù)處理和分析程序，簡化了對(duì)微小芯片的檢測。檢測過程可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，其核心原理是將硅、玻璃或聚二甲基硅氧烷通過微加工，制造具有微米量級(jí)的不同結(jié)構(gòu)和尺寸的管道用于細(xì)胞分選。捕獲和富集是CTCs技術(shù)的關(guān)鍵所在，目前已經(jīng)開發(fā)了多種微流控芯片平臺(tái)[11]。使用這種單細(xì)胞回收裝置，不僅可以通過檢測單細(xì)胞水平的遺傳畸變，還可以通過跟蹤在抗癌治療期間變化來實(shí)施個(gè)性化治療，而且能夠用于活性細(xì)胞回收[12]。

1.7 關(guān)于CTCs標(biāo)本的保存 關(guān)于收集的CTCs血液標(biāo)本的保存，Brungs等[13]比較冷凍保存的標(biāo)本（2周到25.2個(gè)月，中位數(shù)14.6個(gè)月）及新鮮標(biāo)本（24 h內(nèi)）CTCs檢測情況。發(fā)現(xiàn)盡管與冷凍保存標(biāo)本相關(guān)的CTCs數(shù)量有明顯減少的趨勢(shì)。但這主要是在總CTCs計(jì)數(shù)＞ 50的樣本中，低CTCs計(jì)數(shù)樣本受影響小。冷凍保存時(shí)間和CTCs數(shù)量之間沒有顯著關(guān)聯(lián)，冷凍保存延遲隔離是一種有效的策略，有助于樣本收集，運(yùn)輸和處理。

2 CTCs檢測在胃癌中的應(yīng)用

CTCs檢測在胃癌的早期診斷、評(píng)估胃癌術(shù)后預(yù)后、預(yù)測轉(zhuǎn)移性胃癌的化療反應(yīng)、評(píng)估胃癌患者長期預(yù)后、評(píng)估晚期胃癌的治療反應(yīng)和預(yù)后、篩選胃癌靶向治療可能獲益的患者等方面具有重要的作用。同時(shí),構(gòu)建了CTCs動(dòng)物模型，為進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

2.1 CTCs在胃癌的早期診斷中的作用 作為生物標(biāo)志物，CTCs在胃癌的早期診斷中具有潛在的作用。有研究[14]將116名接受胃切除術(shù)的胃癌患者和31名健康志愿者進(jìn)行前瞻性研究。在胃切除術(shù)前收集外周血樣本，使用離心微流控系統(tǒng)和新型液體輔助分離技術(shù)檢查CTCs，檢查的靈敏度和特異性幾乎在每7.5 mL血液CTCs閾值2時(shí)優(yōu)化。在每7.5mL血液中CTCs水平≥2的102名患者中，99名患有胃癌。在每7.5 mL血液中CTCs水平＜2的45名患者中，28名是健康對(duì)照。郭迎雪等[15]選擇了80例胃癌患者、50例慢性胃炎患者和50名健康志愿者，治療前抽取外周血7.5 mL用Cell Search 方法計(jì)數(shù)靜脈血中CTCs 數(shù)目，發(fā)現(xiàn)胃癌患者CTCs計(jì)數(shù)顯著高于慢性胃炎患者和健康人，與血清CA724水平成正相關(guān)。胃癌外周血CTCs計(jì)數(shù)與患者臨床特征有一定相關(guān)性，并有望成為早期診斷胃癌的新的血液學(xué)指標(biāo)。

2.2 監(jiān)測胃癌術(shù)前和術(shù)后CTCs的變化評(píng)估預(yù)后 通過檢測CTCs，評(píng)估可切除的胃癌的術(shù)前和術(shù)后CTCs變化以及可能與術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)性。Zhang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)化的Cell Search系統(tǒng)檢測胃癌患者CTCs，臨床病理特征相對(duì)較差的患者有更多的術(shù)前和術(shù)后CTCs。CTCs≥5/7.5 mL患者，3年無病生存率（disease-free survival，DFS）顯著低于CTCs ＜5 / 7.5 mL患者。術(shù)后血液中CTCs≥5/ 7.5mL的患者與其他患者相比，平均DFS和總生存期（overall survival，os）均短。根治性手術(shù)后不同臨床分期胃癌患者的CTCs存在差異，術(shù)后2年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況存在差異。狄劍士等[17]研究60 例胃癌根治術(shù)患者外周血中CTCs，Ⅰ期陽性率9.1%，Ⅱ期陽性率33.3%，Ⅲ期陽性率64.3%，Ⅲ期陽性率與Ⅰ期、Ⅱ期的陽性率不同，Ⅰ期CTCs 陽性患者2年內(nèi)未轉(zhuǎn)移；Ⅱ期CTCs陽性患者6～12個(gè)月無轉(zhuǎn)移，4例患者12～24個(gè)月出現(xiàn)不同程度的肝、肺、骨轉(zhuǎn)移；Ⅲ期CTCs陽性患者6-12個(gè)月內(nèi)肝轉(zhuǎn)移1例，12～24個(gè)月出現(xiàn)肝臟轉(zhuǎn)移2例、肝肺和骨同時(shí)轉(zhuǎn)移3例、骨轉(zhuǎn)移1例、肺和顱內(nèi)轉(zhuǎn)移1例，轉(zhuǎn)移率Ⅲ期高于Ⅱ期和Ⅰ期。

2.3 CTCs預(yù)測轉(zhuǎn)移性胃癌化療反應(yīng) CTCs與轉(zhuǎn)移性胃癌患者化療反應(yīng)不佳有關(guān)。Lee等[18]研究100名轉(zhuǎn)移性胃癌患者，95名患者中的27名檢測到5個(gè)或更多CTCs（CTCs陽性）。盡管CTCs陽性組和CTCs陰性組的臨床特征沒有顯著差異，但CTCs陽性組對(duì)化療有顯著反應(yīng)，CTCs陽性組的中位無進(jìn)展生存期明顯短于CTCs陰性組。對(duì)于總體存活，CTCs陽性組的存活率顯著短于CTCs陰性組，CTCs陽性是無進(jìn)展生存和總體生存的獨(dú)立不利因素。

2.4 CTCs評(píng)估晚期胃癌患者預(yù)后 CTCs水平可能有助于評(píng)估晚期患者的治療反應(yīng)并預(yù)測其預(yù)后，治療后CTCs的變化可能有助于快速識(shí)別無效治療和不良預(yù)后[19]。Liu等[20]納入59例化療胃癌晚期患者，經(jīng)多變量分析表明，化療第一周期后CTCs計(jì)數(shù)的增加僅是無進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）差的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)?；€CTCs計(jì)數(shù)＞ 2細(xì)胞/ 5 mL血液是PFS和OS的獨(dú)立不良預(yù)后標(biāo)志物。在第一輪化療后，基線CTCs計(jì)數(shù)低或CTCs計(jì)數(shù)降低的患者可能會(huì)從姑息性化療中獲益。有研究[21]在晚期胃癌患者中測定CTCs，鑒定出兩種具有不同閾值的CTCs亞型，為多發(fā)性CTCs及多倍體+三倍體CTCs。在治療最初6周后，多倍體CTCs增加≥10%的患者PFS和OS較差，治療后多倍體CTCs增加≥10%是PFS和OS的唯一獨(dú)立預(yù)測因子，CTCs的非整倍性與晚期胃癌患者的預(yù)后相關(guān)。朱瑩等[22]將35例HER-2陰性晚期胃癌患者設(shè)為胃癌組，同時(shí)設(shè)良性胃病對(duì)照組 (20例) 和健康對(duì)照組 (20例)。在治療前，取外周靜脈血標(biāo)本3.2 mL，采用免疫磁珠微粒陰性富集技術(shù)檢測CTCs。胃癌組CTCs檢測陽性率為31.4%，對(duì)照組均未檢出CTCs，結(jié)果HER-2陰性晚期胃癌患者外周血CTCs檢測結(jié)果與轉(zhuǎn)移部位數(shù)目相關(guān), 可用于預(yù)后評(píng)估。

2.5 CTCs評(píng)估胃癌患者長期預(yù)后 較低數(shù)量的CTCs與較高的無復(fù)發(fā)生存率（relapse-free survival，RFS）相關(guān)，可預(yù)測胃癌長期預(yù)后。Ito 等[23]研究，手術(shù)前從治療陰性的胃腺癌患者中獲取7.5 mL外周靜脈血樣，使用OBP-401檢測CTCs，CTCs數(shù)量隨著疾病進(jìn)展而趨于增加。7.5 mL外周血中超過5個(gè)CTCs患者，OS低于5個(gè)或更少CTCs患者。在超過5的患者和具有5個(gè)或更少CTCs的患者之間，發(fā)現(xiàn)RFS的顯著差異。

2.6 CTCs評(píng)估胃癌靶向治療療效 成功使用靶向治療腫瘤的關(guān)鍵，是能夠根據(jù)分子標(biāo)記預(yù)選可能從治療中受益的患者，而預(yù)測治療反應(yīng)的評(píng)估主要依靠腫瘤活檢。Mishima等[24]將CTCs檢測作為補(bǔ)充原發(fā)性腫瘤活檢的一種非侵入性潛在策略，以期找到可能從曲妥珠單抗治療中獲益的患者，發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤為HER-2，但其CTCs顯示HER-2擴(kuò)增以選擇可能受益于曲妥珠單抗治療的患者。

3 CTCs在胃癌動(dòng)物模型構(gòu)建的作用

胃癌CTCs動(dòng)物模型構(gòu)建為CTCs在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用奠定了研究基礎(chǔ)。周洲等[25]構(gòu)建了4種胃癌裸鼠模型，包括皮下移植瘤、原位移植瘤、腹腔移植瘤、尾靜脈移植瘤，檢測各組腫瘤生長、轉(zhuǎn)移水平，比較各組循環(huán)血中CTCs數(shù)目，并進(jìn)一步行單細(xì)胞實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析轉(zhuǎn)移相關(guān)基因在CTCs與原細(xì)胞中的表達(dá)變化，免疫組織化學(xué)法檢測腫瘤組織中血管的生成情況。發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞原位移植模型裸鼠死亡率低，腫瘤轉(zhuǎn)移明顯，CTCs數(shù)量明顯高于其他造模方法，是研究胃癌CTCs的理想模型。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞已被認(rèn)為是包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤的潛在預(yù)后指標(biāo)；在癌癥治療的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用方面具有很大的潛力；它提供了獲得個(gè)性化藥物開發(fā)所需的關(guān)鍵生物信息的機(jī)會(huì)。CTCs捕獲提供了對(duì)癌組織的實(shí)時(shí)監(jiān)測，而無需進(jìn)行侵入性活組織檢查，CTCs的研究是一個(gè)令人興奮的研究領(lǐng)域。然而，目前的CTCs檢測方法在特異性和敏感性方面面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，現(xiàn)有的CTCs隔離裝置的制造工藝復(fù)雜且材料昂貴。因此，迫切需要開發(fā)一種新的平臺(tái)，以降低成本，大規(guī)模高性能實(shí)現(xiàn)CTCs檢測。在臨床中，CTCs被認(rèn)為在癌癥轉(zhuǎn)移中具有關(guān)鍵作用，胃癌患者的死亡主要是由于其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。而CTCs是轉(zhuǎn)移的必要條件，進(jìn)行治療前和治療后監(jiān)測CTCs，可用于早期檢測亞臨床患者或疾病復(fù)發(fā)，預(yù)測腫瘤進(jìn)展和輔助化療的效果。CTCs檢測對(duì)胃癌的診斷、治療和預(yù)后具有重要意義。