間充質(zhì)干細(xì)胞在結(jié)核病治療中的應(yīng)用與問題

吳蓓蓓 黃薇 王志敏

目前，針對耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)的治療原則主要是采取多種二線抗結(jié)核藥物聯(lián)合使用的治療方案，但聯(lián)合化療的藥物不良反應(yīng)大，患者耐受不佳，甚至還可能使患者產(chǎn)生新的耐藥風(fēng)險(xiǎn)[1]。因此，科學(xué)家們一直在嘗試尋找新的方法治療MDR-TB。疫苗是科學(xué)家們首先想到并且進(jìn)行開發(fā)的治療手段。1921年，Albert Calmette和Camille Guérin經(jīng)過13年的努力共同研制成功了預(yù)防MTB感染的人工疫苗卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)[2]。BCG自從面世以來，全球約有40億人接種[3]。然而隨著時(shí)間推移，人們發(fā)現(xiàn)由于環(huán)境、人群基因，以及MTB基因不同其對于成人保護(hù)效果差異很大。因此，人們開始嘗試對BCG進(jìn)行基因重組改造以提高其免疫效果[4]，以及過表達(dá)BCG保護(hù)性抗原Ag85B，減少免疫系統(tǒng)對BCG的干擾等[5]。

細(xì)胞免疫在抵抗MTB的感染過程中發(fā)揮著非常重要的作用，并且巨噬細(xì)胞是人類抗擊MTB的第一道防線，MTB在進(jìn)入到人體內(nèi)后，巨噬細(xì)胞先識別MTB，再和MTB相連，最后將其吞噬消滅[6]。另一方面T淋巴細(xì)胞分泌的γ干擾素(IFN-γ)可以激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生活性一氧化氮(NO)和相關(guān)的氮元素中間產(chǎn)物(reactive nitrogen intermediates，RNI)，這些細(xì)胞因子可以通過底物左旋精氨酸(L-arginine)產(chǎn)生一些抗生素[7]。但是研究表明，MTB可以通過阻止被感染的細(xì)胞被免疫系統(tǒng)識別，以及抵抗巨噬細(xì)胞的消滅病菌的功能使得其自身可以同宿主細(xì)胞共存[8]。隨著細(xì)胞治療研究的深入，特別是對間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)的深入探究，科學(xué)家們看到了新的曙光。

一、MSC生物學(xué)特性

MSC是來源于發(fā)育早期中胚層的多能干細(xì)胞，主要分布于骨髓、骨、軟骨、脂肪等多種組織的細(xì)胞，在一定的條件下可以分化為骨、軟骨、脂肪等多種細(xì)胞。原代的MSC呈長梭性，形態(tài)類似于成纖維細(xì)胞，易黏附在塑料的培養(yǎng)器皿壁上生長。2006年，國際細(xì)胞治療協(xié)會(International Society for Cellular Therapy，ISCT)發(fā)布了鑒定MSC的標(biāo)準(zhǔn)，即MSC是一類可黏附于塑料的培養(yǎng)器皿壁上，具有成骨、成軟骨、成脂的分化潛能，并且CD105、CD73、CD90表達(dá)量在95%以上，而CD45、CD34、CD14 或者CD11b、CD79a或者CD19 以及 HLA-DR表達(dá)量在2%以下[9]。

二、MSC參與結(jié)核病的免疫調(diào)節(jié)

近些年由于科學(xué)家發(fā)現(xiàn)MSC能參與免疫調(diào)控等作用因而越來越受到人們的關(guān)注[10]。2010年， Mei等[11]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過MSC靜脈注射處理的患有敗血癥小鼠，炎癥相關(guān)因子白細(xì)胞介素(IL)-10、IL-6基因等明顯下調(diào)，而一些促進(jìn)吞噬作用進(jìn)而殺死細(xì)菌的基因明顯上調(diào)。此后，Malek等[12]發(fā)現(xiàn)將MSC靜脈注射到被MTB感染的小鼠后，小鼠肺部的大量細(xì)胞均能檢測到干細(xì)胞抗原1(stem cells antigen-1，SCA-1), 即小鼠干細(xì)胞的特征，這些細(xì)胞表達(dá)CD29、CD44、FLK-1，但不表達(dá)CD34、CD45、CD11b和GR1，從而進(jìn)一步證實(shí)MSC滲入到MTB感染的小鼠肺部。通過組織學(xué)分析，MSC浸潤到肺部以后，在MTB周圍形成了肉芽腫，建立了免疫抑制的區(qū)域，并且限制了MTB的播散[13]。研究表明，免疫反應(yīng)太弱不利于抑制MTB的生長繁殖，然而免疫反應(yīng)太強(qiáng)又會損傷機(jī)體自身[14]。隨后，Kim等[15]將MSC注射到被MTB感染的小鼠中發(fā)現(xiàn)，其不僅提高了被感染小鼠的存活率，也促進(jìn)了肺和脾臟內(nèi)MTB的裂解，并且還能抑制MTB在骨髓巨噬細(xì)胞中的生長。此外，MSC分泌的前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)通過上調(diào)NF-кB信號增加了巨噬細(xì)胞NO的分泌[16]，NO的分泌抑制了CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的反應(yīng)，從而使得免疫系統(tǒng)在防御病原體及其避免自身免疫反應(yīng)之間達(dá)到動態(tài)平衡；并且MSC促進(jìn)IFN-γ、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)等細(xì)胞因子分泌，而這些細(xì)胞因子誘導(dǎo)MSC高表達(dá)NO合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)，從而進(jìn)一步促進(jìn)了巨噬細(xì)胞NO的分泌[17]。而當(dāng)細(xì)胞免疫過于低下時(shí)，自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)會分泌微量的IFN-γ，從而促使MSC增加的趨化因子配體-2(the chemokine C-C motif ligand 2，CCL2)/單核細(xì)胞化學(xué)引誘物蛋白質(zhì)-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)的合成，而CCL2/MCP-1在連通IL-12和IL-18后會促使NK細(xì)胞大量合成IFN-γ，形成了反饋循環(huán)，增強(qiáng)了NK細(xì)胞的免疫殺傷作用[18]。

三、MSC的趨化特性

MSC除了參與到免疫調(diào)節(jié)過程中，還具有特殊的趨化性來幫助炎癥部位的恢復(fù)。趨化因子是一類相對分子質(zhì)量為8000～10 000的小分子物質(zhì)，主要有CC、CXC、C、CX3C這幾類[19]。2004年，Abbott等[20]分析了基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)在MSC歸巢現(xiàn)象中的作用。科學(xué)家們通過腺病毒轉(zhuǎn)染提高心肌梗死小鼠梗死部位SDF-1的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)會明顯增加MSC向梗死部位遷移的數(shù)量；而對照組無心肌梗死損傷的情況下，并不會增加MSC的募集數(shù)量。 而Wang等[21]發(fā)現(xiàn)MCP-1、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1a(macrophage inflammatory protein-1a，MIP-1a)和IL-8在大鼠缺血腦組織中均有表達(dá)，靜脈注射MSC后，MSC在這三種趨化因子的協(xié)同作用下向損傷的腦組織遷移，并且修復(fù)腦組織損傷[22]。2013年，Wang等[23]證實(shí)外源性的MSC在炎癥因子和趨化因子的協(xié)同作用下向肺損傷部位聚集，并且進(jìn)一步分化為肺泡細(xì)胞及其血管內(nèi)皮細(xì)胞等修復(fù)損傷組織。2017年，Nenasheva等[24]用熒光染料羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)對MSC標(biāo)記后，靜脈注射入結(jié)核病小鼠體內(nèi)，3 h后其中(12.63±10.24) %的細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)進(jìn)入到小鼠肺部，也進(jìn)一步證實(shí)了MSC的趨化特性。

四、MSC療法的探索

近些年，科學(xué)家們在細(xì)胞和動物水平上均證實(shí)了MSC能參與到肺部疾病治療上。Yudintceva等[25]將感染了結(jié)核分枝桿菌的新西蘭兔的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞提取后，用超順磁氧化鐵納米粒子(superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPION)進(jìn)行標(biāo)記后回輸?shù)酵皿w內(nèi)以治療泌尿生殖系統(tǒng)結(jié)核。經(jīng)過觀察，發(fā)現(xiàn)兔膀胱的變形和炎癥反應(yīng)明顯下降，并且纖維化程度也明顯降低。2015年，Zuo等[26]首次在支氣管上皮基底層位置鑒定到了具有肺再生功能的p63+/Krt5+雙陽性遠(yuǎn)端氣管干細(xì)胞(distal airway stem cells，DASC)，在流行性感冒病毒誘導(dǎo)的小鼠急性呼吸窘迫綜合征模型中，內(nèi)源的DASC能迅速地?cái)U(kuò)增并分化成微支氣管和肺泡細(xì)胞等具有各種功能的細(xì)胞，從而重建整個(gè)肺結(jié)構(gòu)，制造出了首個(gè)“換肺”的小鼠模型。隨后，在同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院對肺纖維化患者開展了臨床試驗(yàn)[27]。而對于結(jié)核病患者科學(xué)家們也已經(jīng)開展了相關(guān)的臨床實(shí)驗(yàn)。2005年開始，Erokhin等[28]對15例MDR-TB和12例XDR-TB患者分別進(jìn)行了自體MSCs全身性輔助化療，發(fā)現(xiàn)所有患者的臨床癥狀均得到了改善，其中20例患者在治療3～4個(gè)月以后痰菌明顯降低；在治療1.5～2年以后，有9例患者長期隨訪中無復(fù)發(fā)。從2009年開始，Skrahina等[29]用患者自體的MSC全身移植治療MDR-TB，而后觀察到患者的肺部空洞逐漸縮小。 2014年，Skrahin等[30]報(bào)道了一項(xiàng)臨床試驗(yàn)，將60例患者(年齡范圍21～65歲)隨機(jī)分為2組，其中30例經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)抗結(jié)核藥物治療4周后接受單劑量的MSC注射治療(試驗(yàn)組)，而另外30例只接受標(biāo)準(zhǔn)抗結(jié)核藥物治療(對照組)。18個(gè)月后，試驗(yàn)組的治愈率(53.33%)是對照組(16.67%)的近3倍，并且安全性良好，無藥物不良反應(yīng)。這些臨床試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了MSC治療結(jié)核病的可行性。

五、MSC治療結(jié)核病存在的問題

MSC治療疾病的機(jī)制尚未明確，并且對于不同的疾病和個(gè)體都存在一定的差異性，但由于MSC低免疫原性及參與免疫調(diào)節(jié)等作用，讓人們在很多疑難雜癥(包括結(jié)核病，特別是MDR-TB)的治療上都看到了曙光。盡管如此，世界范圍內(nèi)目前批準(zhǔn)的干細(xì)胞藥物依然有限，這項(xiàng)技術(shù)依然需要完善。

首先，由于受到傳代次數(shù)的限制，無論是自體還是異體的移植，年輕而又足量MSC的來源一直是移植上需要解決的問題[31]。其次，即使治療成功的結(jié)核病患者，依然可以從自體的MSC中檢測到MTB，而生長因子CD271+可長期潛伏于骨髓MSC并且可長時(shí)間在宿主細(xì)胞內(nèi)提供保護(hù)[32]。因此，移植MSC時(shí)是否需要去除CD271+ MSC還有待進(jìn)一步的研究。而Raghuvanshi 等[13]和Ramakrishnan[33]都發(fā)現(xiàn)， MSC形成的肉芽腫限制了MTB的活動，但另一方面卻也限制了T淋巴細(xì)胞的免疫活性，協(xié)助了MTB的免疫逃逸，使MTB可長期潛伏于患者體內(nèi)。

六、總結(jié)和展望

盡管MSC治療結(jié)核病尚存在一些問題，但依然給患者帶來了新的希望。目前，仍需要大量的機(jī)制研究和臨床試驗(yàn)以進(jìn)一步評價(jià)MSC治療的可行性和安全性。此外，根據(jù)人群個(gè)體的差異，MSC治療的劑量、時(shí)間，以及運(yùn)輸過程中的儲存、凍存、復(fù)蘇等問題都尚未完全解決。隨著再生醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，相信不久的將來MSC的這些問題會逐步解決，真正幫助到結(jié)核病患者。