環(huán)狀RNA在神經(jīng)膠質瘤中的研究進展

戚前生， 趙紅， 劉建雄

神經(jīng)膠質瘤是1種起源于中樞神經(jīng)細胞的腫瘤，占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的27%，以發(fā)病率高、死亡率高、侵襲性強、預后差為主要特點[1]。近年來神經(jīng)膠質瘤患病率逐年增加，盡管在診斷和治療方面取得了明顯進展，但患者的中位生存率依舊較低[2]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在神經(jīng)膠質瘤的基因調節(jié)、發(fā)生發(fā)展、表達和遷移中都起著重要的調節(jié)作用，可作為神經(jīng)膠質瘤靶向治療的新方向及疾病診斷和預后的生物學標志物[3]。

1 概述

circRNA是1種特殊的內(nèi)源性非編碼RNA，由前體RNA的3′末端與5′末端首尾相連形成閉合環(huán)狀結構[4]。20世紀70年代，circRNA在RNA病毒中首次發(fā)現(xiàn)，但未引起足夠重視[5]。隨著RNA測序技術和生物信息學的快速發(fā)展，Salzman等[6]證明circRNA在哺乳動物中廣泛存在，并具有高度穩(wěn)定性、保守性以及調控的復雜性，在疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著重要角色[7]。

1.1 circRNA可作為 miRNA海綿因子 miRNA是一大類非編碼小RNA，主要通過堿基互補配對直接綁定在信使RNA(mRNA)上，circRNA幾乎參與了腫瘤相關的所有過程，包括增殖、分化、凋亡、轉移及血管生成等。2013年，Hansen等[8]首次證明了circRNA以吸附miRNA的方式(即miRNA的海綿作用)來發(fā)揮作用，circRNA富含miRNA結合位點并在細胞中充當miRNA海綿，從靶基因位點上隔離miRNA進一步影響了mRAN的翻譯[9]。同時circRNA還可因分子海綿的作用來保護3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)免受miRNA的攻擊[10]?，F(xiàn)多項研究已證實了circRNA在神經(jīng)腫瘤組織、心血管系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用，并取得重大成果[11]。

1.2 circRNA是轉錄、剪切的調節(jié)器 circRNA通過與染色質或其親本基因的啟動子結合來激活轉錄的表達并調控親本基因[7]。研究發(fā)現(xiàn)，外顯子-內(nèi)含子circRNAs中含有的環(huán)狀PAIP2(circPAIP2)和環(huán)狀EIF3J(circEIF3J)，能夠與U1小核核糖核蛋白抗體(U1snRNP)結合形成復合物，并可與RNA 聚合酶 Ⅱ(polⅡ)相互作用進一步促進親本基因的轉錄[9]。CircRNA剪接過程與mRNA不同，在前體RNA剪接過程中，反向剪接產(chǎn)生的 circRNA 能夠競爭性調控可變剪接。剪接因子(MBL)與環(huán)狀RNA剪切因子結合物(circMbI)緊密結合并相互影響各自的表達[12]。

1.3 CircRNA的編碼蛋白功能 乙型肝炎病毒(HBV)的亞病毒——丁型肝炎病毒(HDV)是最早期在真核細胞中發(fā)現(xiàn)的能編碼蛋白質的circRNA[13]。1995年Chen等[14]通過核糖體掃描模型技術進一步證實了circRNA在真核細胞中具有編碼蛋白質的功能；并且發(fā)現(xiàn)circRNA可以直接與核糖體IRES元件(內(nèi)部核糖體進入位點)結合或在mRNA的5′末端結合后轉移到IRES上，從而進一步編碼相應蛋白質。其中，Circ-ZNF609是1種可在真核細胞核糖體上轉譯的circRNA。其轉譯過程與線性轉錄類似，Circ-ZNF609基因包含了從起始密碼子到終止密碼子的開放閱讀框(ORF)，以此來轉錄特定基因。但Circ-ZNF609的翻譯形式與5′-3′翻譯形式不同，其主要依賴于剪接的方式被翻譯成蛋白質，這也在真核生物的蛋白質編碼circRNA中提供了實例[15]。此外，Pamudurti等[16]應用核糖體印記技術在果蠅中找到了許多與翻譯核糖體相關的circRNA，并通過質譜技術發(fā)現(xiàn)1個來自剪接因子(MBL)位點的 circRNA，能夠編碼蛋白質。最新研究發(fā)現(xiàn)，在酵母細胞中circRNA的宿主基因(CNM01190)有2種選擇性的剪切產(chǎn)物，可分別對174-aa和252-aa蛋白質進行編碼，尤其在轉譯和碳水化合物代謝過程中發(fā)揮重要作用[17]。

1.4 CircRNA的抗病毒免疫反應 近期研究發(fā)現(xiàn)，免疫因子NF90/NF110能調節(jié)circRNA的生物合成，并通過與病毒中的mRNA相互作用抑制感染。其中免疫因子NF90/NF110是一類與抗病毒免疫相關的反式作用因子，NF90/NF110的相關雙鏈RNA結構域為circRNA生物發(fā)生的關鍵調控因子，促進細胞核中circRNA的產(chǎn)生；其還可與細胞質中的成熟circRNA相互作用。在病毒感染時circRNA的表達逐漸減少，因當體內(nèi)發(fā)生病毒感染時，細胞質中成熟的circRNA被釋放出來結合到病毒mRNA上，發(fā)揮抗病毒的作用[18]。Wang等[19]研究發(fā)現(xiàn)了circRNA在免疫調節(jié)和病毒感染中的干預作用，并可用于臨床中的抗病毒治療。

1.5 CircRNA 異常表達的基因組區(qū)域 CircRNA-miRNA-mRNA軸是1種經(jīng)證實的癌癥相關通路的調控模式，在癌細胞的發(fā)生發(fā)展過程中既有激動作用也有拮抗作用。與癌癥發(fā)生相關的 miRNA多位于敏感位點或多種癌癥相關的基因組區(qū)域，這些區(qū)域是基因突變、染色體易位等遺傳物質畸形的好發(fā)位點[20]。通過基因測序、基因芯片等相關分析，這些癌癥患者的組織中可以檢測到許多基因和染色體異常表達的miRNA。而circRNA的表達也會發(fā)生相應改變，且circRNA存在于血液、分泌液及組織中，可作為檢測癌癥的有效生物標志物[21]。例如，白血病等血液相關的惡性腫瘤其根本原因是源于染色體的易位，癌癥相關的染色體易位也可以產(chǎn)生線性融合miRNA和融合circRNA(f-circRNA)，二者都涉及癌癥的發(fā)生和發(fā)展[22]。雖然目前還沒有研究結果能夠說明在神經(jīng)膠質瘤中circRNA的異常表達與遺傳物質改變之間存在確切的聯(lián)系，但是已證實遺傳物質改變可引起 miRNA 的異常表達。但circRNA 的異常表達與癌細胞的發(fā)生發(fā)展之間的相互關系還需要深入的研究探索。

2 circRNA在神經(jīng)膠質瘤中的作用

癌癥基因組圖譜(TCGA)始于2005年，其目的是利用基因組測序和生物信息學對腫瘤基因突變進行精準的編目[23]。為了早期明確診斷、控制疾病進展，并提高膠質瘤患者的治療效果，必須篩選與神經(jīng)膠質瘤生物學相關且更有效的生物標志物。目前，與膠質瘤診療方面相關的長鏈非編碼RNA(lncRNA)和circRNA 的研究已成為熱點話題，可以進一步提供對腦膠質瘤的洞察?；蚪M分析研究表明：與正常腦組織相比，神經(jīng)膠質瘤患者的腫瘤組織中存在多種circRNA 的異常表達，不同惡性程度的神經(jīng)膠質瘤中同1種circRNA的表達程度也不同。因此circRNA 可能在神經(jīng)膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著一定作用。

2.1 circRNA可調節(jié)神經(jīng)膠質瘤細胞的周期 近無限增殖是腫瘤細胞的重要特征之一[24]。腫瘤細胞的過度表達、增殖在影響細胞周期調節(jié)的紊亂中起著重要作用[25]。許多研究表明，circRNA在腫瘤增殖控制中扮演著內(nèi)源競爭RNA(competing endogenous，ceRNA)的角色。比如，有些circRNA 可影響表皮生長因子受體(EGFR)下游的信號通路，參與了結腸癌、胃癌和肝癌的增殖調控[26]；有些circRNA可以通過靶向參與調控細胞周期的關鍵分子來調節(jié)細胞增殖。p21基因是細胞周期依賴性激酶1(CDK1)家族的成員之一，同時也是細胞周期的負調控因子，且p21靶向誘導細胞周期阻滯并阻止肝癌細胞增殖[27]。目前研究小組在神經(jīng)膠質瘤的相關研究中發(fā)現(xiàn)，若敲除相應的基因可抑制膠質瘤的增殖從而促進其凋亡。Kumar等[28]研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0046701基因在膠質瘤組織和細胞系中過度表達，若敲出hsa_circ_0046701基因則可抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲；研究進一步表明hsa_circ_0046701基因可通過促進miR-142-3p基因的靶標-ITGβ8(整聯(lián)蛋白亞基β8)的表達，從而影響神經(jīng)膠質瘤的增殖和侵襲。因此，進一步證實了hsa_circ_0046701/miR-142-3p/ITGB8環(huán)路參與神經(jīng)膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展。Yang等[29]在神經(jīng)膠質瘤細胞中發(fā)現(xiàn)cZNF292 基因與管腔形成相關。cZNF292基因是重要的環(huán)狀致癌RNA，在腫瘤管腔形成過程中起重要作用，敲除之可抑制細胞增殖，并通過 Wnt/-連環(huán)蛋白(Wnt/β-catenin)信號通路致使細胞周期停滯。Li等[30]研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0007534基因在膠質瘤組織中高度表達，然而敲除hsa_circ_0007534基因則可抑制神經(jīng)膠質瘤的發(fā)生發(fā)展。Zic基因具有鋅指結構，是轉錄因子基因家族的一員，在調節(jié)生物生長發(fā)育過程中扮演著至關重要的作用。鋅指蛋白ZIC5的過度表達促進了人類癌癥的發(fā)展。ZIC5是miR-761基因的靶標，hsa_circ_0007534基因通過在膠質瘤細胞中抑制miR-761基因來促進ZIC5的表達；研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0007534基因與ZIC5默契的配合則可抑制miR-761基因的表達，挽救神經(jīng)膠質瘤細胞的增殖和遷移；并且發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0007534基因表達水平與膠質瘤晚期腫瘤分級(Ⅲ/Ⅳ)呈正相關。此外，hsa_circ_0007534基因的降解顯著抑制了膠質瘤細胞的增殖和遷移，說明circRNA對神經(jīng)膠質瘤細胞的分化也起一定作用，hsa_circ_0007534/miR-761/ZIC5調控環(huán)可能是神經(jīng)膠質瘤治療的有希望的治療靶點。

2.2 circRNA調節(jié)神經(jīng)膠質瘤細胞的凋亡 凋亡的喪失是腫瘤的又一個重要特征。最近的研究發(fā)現(xiàn)，一些circRNA參與調控腫瘤細胞的凋亡[31]。Bcl-2家族蛋白在凋亡通路中起著關鍵作用。抗凋亡蛋白Bcl-2位于線粒體外膜，抑制細胞色素C等凋亡因子的釋放，而Bcl-2是miR-143的靶標，circRNA可作為miRNA的海綿在調節(jié)凋亡通路中起著關鍵的作用[32]。Zhang等[33]研究發(fā)現(xiàn)，SNF2組蛋白連接子PHD環(huán)解螺旋酶的環(huán)狀形式(circ-SHPRH)可以編碼SHPRH-146aa，保護SHPRH免于泛素蛋白酶降解，二者均在正常的人類大腦中廣泛存在并高度表達。但在膠質母細胞瘤中呈下調趨勢，因此SHPRH-146aa的過表達降低了其在體內(nèi)惡性行為和致瘤性。circ-SHPRH因具有產(chǎn)生 “UGA”停止密碼子的功能，促使SHPRH-146aa的翻譯，進一步推測circ-SHPRH和SHPRH-146aa是人類膠質母細胞瘤的腫瘤抑制因子，促進膠質瘤細胞凋亡。

2.3 circRNA參與神經(jīng)膠質瘤的侵襲和遷移 對于惡性腫瘤而言，侵襲和遷移是不可缺少的特征。上皮間質轉換(epithelial interstitial transformation，EMT)在調節(jié)許多腫瘤早期侵襲和遷移中扮演著重要角色[34]。在EMT和腫瘤相互作用過程中發(fā)現(xiàn)表皮生長因子(FGF)、胰島素生長因子(IGF)和肝細胞生長因子(HGF)參與其中[35]，同時miRNA也參與了EMT調控。circRNA作為miRNA的海綿，且其具有的特異轉錄、剪切等調節(jié)功能，也可以通過內(nèi)源性競爭機制參與EMT的調控，從而影響腫瘤的侵襲和遷移。血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)是EMT中重要的血管生成因子[36]，高表達的環(huán)狀RNA-肌球蛋白輕鏈肌酶(circRNA-MYLK)在膀胱癌中可以通過將miR-29a結合為RNA海綿來增加VEGFA的 mRNA表達，從而促進腫瘤細胞的遷移[37]。Zheng等[38]研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)膠質瘤中， 肝細胞核因子1(HNF1)是miR-217的直接靶標，在膠質瘤細胞中發(fā)揮致癌作用。而circ-TTBK2是1種僅含有外顯子的circRNA基因，由TTBK2基因的外顯子3、外顯子4、外顯子5和外顯子6產(chǎn)生，也可以結合并滅活miR-217，通過HNF-1β促進磷脂酰肌醇-3-羥基酶(PI3K)/(蛋白激酶)AKT-ERK通路激活，引發(fā)起膠質瘤細胞的攻擊，導致腫瘤的惡性程度進一步增高。若敲除circ-TTBK2，則miR-217過表達抑制了體內(nèi)腫瘤的侵襲、遷移，促進其凋亡。

2.4 circRNA 的特點決定了在神經(jīng)膠質瘤診斷中的作用 目前多項研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA和circRNA在神經(jīng)膠質瘤的發(fā)生中起重要的作用，但circRNA與lncRNA不同，circRNA的3′和5′末端未暴露，因此，對核酸外切酶如外切核酸酶不敏感，并且更穩(wěn)定[39]。研究人員已經(jīng)從人類細胞中檢測出3 001個circRNA[40]，其中顯示在控制腦組織和神經(jīng)膠質瘤中有476個circRNA差異表達[41]。與親代基因表達相比，circRNA對某些腫瘤具有特異性，且在一些癌癥患者的癌組織中高表達。如hsa_circ_0013958在肺腺癌的組織、細胞中上調，同時在血漿中也高表達[42]。由于其本身的結構特點使得circRNA在組織、血清和尿液中更穩(wěn)定，高通量測序的發(fā)展消除了鑒定circRNA的障礙。然而迄今為止，circRNA尚未被臨床使用，一個完整可靠的診斷或預后標記標準有待進一步探索，可能為膠質瘤非編碼RNA的潛在機制提供了新的線索。

2.5 circRNA可在神經(jīng)膠質瘤治療及其預后中貢獻出更大的力量 circRNA 的異常表達可以指導神經(jīng)膠質瘤患者選擇不同的治療方案。替莫唑胺(TMZ)[43]是1種烷化劑，通過攻擊腫瘤細胞的DNA誘導癌細胞死亡，是臨床上化療腦膠質瘤的一線常用藥物之一，但因其易耐藥是導致化療失敗的主要原因。miR-24-3p因子在膠質瘤細胞中過表達，通過下調骨形態(tài)發(fā)生蛋白3(BNIP3)促進腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲[44]。最新研究發(fā)現(xiàn)， 內(nèi)皮單核細胞活化多肽Ⅱ(EMAP-Ⅱ)可抑制血管生成促進內(nèi)皮細胞的凋亡，并能直接促進腫瘤細胞的自噬和凋亡。EMAP-Ⅱ與TMZ結合后降低了miR-24-3p的表達，從而增強了TMZ對體外和體內(nèi)生殖干細胞(GSCs)的增殖、遷移和侵襲的細胞毒性作用，進一步增強了治療效果[45]，circRNA在此過程中功不可沒。經(jīng)miR-24-3p(-)、EMAP-Ⅱ和TMZ聯(lián)合治療，最終表現(xiàn)出腫瘤的低惡性度和最長的生存率。研究發(fā)現(xiàn)EMAP-Ⅱ還可促進腫瘤壞死因子受體1(TNF-R1)的凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤的功能[46]；并且還增加了血腦屏障的滲透性，進一步促進了腫瘤的凋亡。EMAP-Ⅱ在臨床實踐中具有良好的應用前景，除此之外，最近的證據(jù)表明circRNA在組織發(fā)育、基因調控和癌變過程中起著重要的作用。內(nèi)源性circRNA在人體細胞中編碼功能蛋白，而circ-FBXW7基因和FBXW7-185aa基因對腦膠質瘤有潛在的預后影響，可作為神經(jīng)膠質瘤治療靶點，用于抗神經(jīng)膠質瘤治療[47]。其他circRNAs，如circMTO1，hsa_circ_001395，circUBAP2，circCCDC66，circGFRA1，hsa_circ_0004277和hsa_circ_0005986也是癌癥診斷和預后有價值的標志物。但是要將這些基礎研究真正用于臨床診療還有漫長的過程，需要解決高效、特異性的載體等一系列問題。

3 展望

circRNA 是RNA領域的研究熱點，隨著基因芯片的問世，更進一步促進了circRNA在癌癥領域中的探索?，F(xiàn)經(jīng)證實，circRNA在哺乳動物中廣泛存在，可通過競爭抑制、可變剪接、轉錄調控、編碼蛋白、抗病毒免疫反應、miRNA海綿作用等功能，在神經(jīng)膠質瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲等方面發(fā)揮重要作用。因circRNA 特異的閉合環(huán)狀結構決定了它調控的復雜性，因此需進一步研究挖掘circRNA在神經(jīng)膠質瘤發(fā)生發(fā)展中的其他功能。由于其穩(wěn)定性較高，可在組織、血清和尿液中檢測，若應用于臨床，可為膠質瘤的診療提供新的線索及理論依據(jù)。

circRNA在神經(jīng)膠質瘤等癌癥領域及抗病毒免疫中發(fā)揮重要作用，但在遺傳病、免疫源性疾病等其他領域未見詳細報道。因此，尋求其他疾病相關作用機制具有重大臨床意義。目前，circRNA仍處于研究初期，需要通過進一步的研究找出神經(jīng)膠質瘤發(fā)生、發(fā)展關鍵階段的相關特異circRNA，確定它們的作用機制，通過基因芯片技術，將這些 circRNA 真正用于神經(jīng)膠質瘤診療、預防中，實現(xiàn)精準化及個體化診療，避免神經(jīng)膠質瘤過度診療。