Ogataea minuta來源的內(nèi)切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶的異源表達(dá)和純化

賈元苓， 喜多島敏彥， 李子杰， 高曉冬， 中西秀樹

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

糖基化是一種普遍存在于真核生物中的蛋白質(zhì)翻譯后修飾[1]，糖鏈對(duì)糖蛋白的生化性質(zhì)具有重要的作用。隨著糖組學(xué)的發(fā)展，對(duì)糖鏈結(jié)構(gòu)和功能的研究越來越多。然而，天然糖肽和糖蛋白上的糖鏈結(jié)構(gòu)復(fù)雜，并呈現(xiàn)多樣性，因而很難從中純化出帶有均一糖鏈的糖肽或糖蛋白[2]。目前，化學(xué)酶合成法尤其是利用內(nèi)切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶（ENGase）來合成此類糖肽或糖蛋白是發(fā)展較快且具有實(shí)踐意義的方法[3]。

ENGase（EC 3.2.1.96）是一類糖苷酶，其可以水解N糖鏈上兩個(gè)N-乙酰葡糖胺 （GlcNAc）之間的β-1-4糖苷鍵[4]。在CAZY數(shù)據(jù)庫(kù)中，ENGases被分成了糖苷水解酶（GH）兩大家族，即GH18和GH85[4]。褶皺鏈霉菌（Streptomyces plicatus）來源的Endo-H（Tarentinoand Maley 1974）， 釀 膿 鏈 球 菌（Streptococcus pyogenes）來源的 Endo-S（Collin and Olsén 2001），里氏木霉（Trichoderma reesei）來源的Endo-T（Stals et al 2010）等都從屬于GH18家族，GH85家族的酶包括原玻璃蠅節(jié)桿菌（Arthrobacter protophormiae） 來源的 Endo-A （Takegawa et al 1997），肺炎雙球菌（Streptococcus pneumoniae）來源的 Endo-D （Muramatsu et al 2001）及凍土毛霉（Mucor hiemalis） 來源的 Endo-M（Fujita，Kobayashi et al 2004）等。與GH18家族不同的是，GH85家族的酶不僅具有糖苷水解酶的活性，同時(shí)還具有將糖鏈轉(zhuǎn)移到GlcNAc受體上的轉(zhuǎn)糖基酶活性[5]。近幾年來，ENGases的轉(zhuǎn)糖基活性成為研究的熱點(diǎn)。利用該酶的活性合成帶有均一糖鏈的糖蛋白或糖肽，可以用于糖鏈結(jié)構(gòu)和功能的研究[6-7]。Endo-M和Endo-A都已多次被應(yīng)用，例如合成了糖基化的將血鈣素[8]、帶有完整N-糖鏈的CD52抗原[9]等。但它們也存在著局限性，如Endo-A傾向于識(shí)別高甘露型的糖鏈[10]，已經(jīng)商業(yè)化的Endo-M雖作用的底物范圍較廣，但難獲得大量的純酶[11]，價(jià)格偏貴。

最近，Murakami等發(fā)現(xiàn)Ogataea minuta中存在內(nèi)切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶（Endo-Om），其從屬于GH85家族，不僅可以識(shí)別高甘露糖型的糖鏈同時(shí)還可作用于復(fù)合型的糖鏈[12]。Endo-Om是一種胞質(zhì)蛋白，并且沒有被糖基化修飾。因此，我們選用大腸桿菌表達(dá)Endo-Om，以期解決ENGase產(chǎn)量低、成本高等問題。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株和培養(yǎng)基

E.coliDH5α：由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存；BL21（DE3）、BL21 （DE3）pLysS： 均購(gòu)于博邁德 公 司；pOMEA1-6H3F-Endo-Om、pET 30a： 日本 AIST 提供。

LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，瓊脂粉 20 g（固體），加水定容至 1 L，121 ℃高壓滅菌 15 min；Overnight ExpressTMinstant LB（O/N instant LB）培養(yǎng)基（novegen）：稱取50 g粉末溶于 1 L ddH2O中，加入10 mL甘油，121℃滅菌15 min。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑：T4DNA連接酶、KOD聚合酶，rTaq酶、各種限制性內(nèi)切酶：均購(gòu)于TaKaRa公司；EasySee Western Marker：購(gòu)于北京全市金生物技術(shù)公司；Precision Plus ProteinTMStandards：BIO-RAD。

主要儀器：高效液相色譜儀：Waters；蛋白質(zhì)純化系統(tǒng) AVANT：AKTA；iMarK 酶標(biāo)儀：BIO-RAD。

1.3 表達(dá)載體pET30-10H3F-EOm的構(gòu)建

質(zhì)粒 pOMEA1-6H3F-Endo-Om （Murakami et al，2013）作為模板，使用正向引物AAGGAGATATA CATATGCATCACCATCACCATCACCATCACCATCA CGACTACAAAGACCATGACGG和反向引物TGCT CGAGTGCGGCCGCTCACACCCAAACCTCACTC（下滑線分別為NdeⅠ和NotⅠ的酶切位點(diǎn)）對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得編碼N端帶有10His和3Flag的Endo-Om基因片段。用NdeⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶分別對(duì)基因片段和質(zhì)粒pET30a雙酶切，經(jīng)T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并涂布LB卡那（50 μg/mL）抗性平板。挑選單克隆進(jìn)行PCR和限制性酶切的初步鑒定，將獲得的陽(yáng)性克隆送至上海六合華大基因測(cè)序。獲得的序列結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Endo-Om基因序列比對(duì)，從而得到正確編碼的表達(dá)載體pET30-10H3F-EOm。

1.4 Endo-Om在不同宿主菌的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組表達(dá)載體pET30-10H3F-Endo-Om分別轉(zhuǎn)化到 BL21（DE3）和 BL21（DE3）pLysS 兩種不同菌種的感受態(tài)細(xì)胞中，隨機(jī)挑選4個(gè)轉(zhuǎn)化子于37℃過夜培養(yǎng)。次日，將菌液轉(zhuǎn)接新的LB培養(yǎng)基，起始 OD600從 0.02到 0.06，37℃繼續(xù)培養(yǎng) OD600至0.6~1，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，30℃培養(yǎng)4 h。收集細(xì)胞稀釋至0.1 OD，加入上樣緩沖液制備SDS-PAGE樣品，電泳后分別進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)（R250）染色和蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blotting）分析。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡分析Endo-Om在BL21（DE3）pLysS 的表達(dá)

收集22.5 mL IPTG誘導(dǎo)后的重組大腸桿菌BL21 （DE3）pLysS， 加入 2 mL 破碎緩沖液 A（1 mmol/L的PMSF溶于PBS中）。放置冰上1 h，然后超聲破碎細(xì)胞（1 s破碎，4 s間歇 ×6）。15 000g離心30 min，收集上清液與沉淀，做Western blotting。Western blotting具體操作步驟如下：首先將濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙由上到下的順序放置到電轉(zhuǎn)儀（BIO-RAD），25 V、1.0 A、30 min 轉(zhuǎn) 膜 ， 然 后 用TBST 緩沖液（150 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），0.05%的吐溫）清洗3次后，5%的脫脂牛奶（上海生工）封閉1 h，再用牛奶稀釋4 000倍的一抗 （anti-His Mouse mAb，TRANS） 室溫孵育 3 h。TBST清洗后加入稀釋4 000倍的二抗 （Goat Anti-MouslgG，HRP，TRANS） 孵育 1 h， 最后 TBST 清洗后，ECL顯色試劑 （BIO-RAD）對(duì)其顯色，放入ImageQuant LAS 4000凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

1.6 重組Endo-Om在O/N instant LB培養(yǎng)基中的可溶性表達(dá)

將含有重組轉(zhuǎn)化子的BL21（DE3）pLysS劃線到卡那（50 μg/mL）及氯霉素（34 μg/mL）抗性的 LB 平板，待長(zhǎng)出菌落后接種至5 mL LB抗性的液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日，將菌液轉(zhuǎn)接到2 mL含有卡那及氯霉素抗性的Overnight Express Instant LB培養(yǎng)基，起始OD600約0.1，16℃、200 r/min培養(yǎng)2 d。 80 000g、2 min 離心收集菌體，加入 300 μL 破碎緩沖液A，冰上超聲破碎細(xì)胞 （1 s破碎，4 s間歇，2 min）。14 000g離心10 min收集上清液，同時(shí)用等量的300 μL破碎緩沖液A重懸沉淀，分別取40 μL的上清液和重懸沉淀與10 μL的5×上樣緩沖液混合均勻，水中煮沸5 min，制備SDS-PAGE電泳樣品，電泳后進(jìn)行Westernblotting分析。

1.7 重組Endo-Om的純化

收集100 mL培養(yǎng)于O/N instant LB中的重組大腸桿菌 BL21 （DE3）pLysS， 用 PBS （137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4）洗后重懸于10 mL的破碎緩沖液B（18 mmol/L NaH2PO4， 2 mmol/L Na2HPO4，0.5 mol/L NaCl，50 mmol/L 咪唑，1 mol/L pMSF）， 置于冰上超聲破碎 （40%Amp，1 s 破碎，4 s 間歇，10 min），15 000g、4℃離心20 min，收集上清液，并用0.45 μm的針頭濾頭器過濾。使用蛋白質(zhì)純化儀純化上清液中蛋白質(zhì)。首先，用結(jié)合緩沖液 （18 mmol/L NaH2PO4，2 mmol/L Na2HPO4，0.5 mol/L NaCl，50 mmol/L咪唑，pH 7.4）平衡鎳親和層析柱1 mL HisTrpTMHP（GE），然后上清液以 1 mL/min的流速流過鎳柱。上樣完畢后，用洗滌緩沖液（18 mmol/L NaH2PO4，2 mmol/L Na2HPO4，0.5 mol/L NaCl，200 mmol/L咪唑，pH 7.4）洗去非特異性結(jié)合的雜蛋白質(zhì)，最后使用洗脫緩沖液（18 mmol/L NaH2PO4，2 mmol/L Na2HPO4，0.5 mol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，pH 7.4）洗脫目的蛋白質(zhì)，收集洗脫峰并取樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。檢測(cè)后剩余樣品用透析袋（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）透析，除去高濃度的咪唑，并用BCA試劑盒（Beyotime）檢測(cè)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.8 蛋白質(zhì)的活性檢測(cè)

蛋白質(zhì)的酶活測(cè)定是在10 μL體系中進(jìn)行。首先以100 pmol的NGA2-Asn-Fmoc（由日本AIST提供）作為底物，加入2 μL純化的蛋白酶液（質(zhì)量濃度為35 μg/mL）或5 μL的細(xì)胞破碎液上清液（總蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度為7 mg/mL）到含有100 mmol/L的醋酸鈉（pH 5.3）、0.5 mol/L的氯化鈉緩沖體系中，50℃反應(yīng)1 h（純酶）或 3 h（粗酶液），95℃加熱5 min終止反應(yīng)。然后進(jìn)行高效液相色譜（HPLC）分析其酶活，檢測(cè)條件為ShodexAsahipak NH2P-50 4E色譜柱 （4.6 mm ×250 mm；Showa Denko K.K.，Tokyo，Japan），流動(dòng)相為0.3%的醋酸銨溶于57%乙腈，洗脫 25 min，流速 1 mL/min，激發(fā)波長(zhǎng) 265 nm，發(fā)射波長(zhǎng)315 nm，柱溫40℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)載體pET30-10H3F-EOm在不同宿主菌的誘導(dǎo)表達(dá)

將表達(dá)載體pET30-10H3F-Eom分別轉(zhuǎn)入E.coliBL21（DE3）和 BL21（DE3）pLysS 兩種宿主菌，隨機(jī)選取4個(gè)陽(yáng)性克隆，采用1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)Endo-Om表達(dá)。從圖1可知，在兩種不同的菌種中，IPTG都促進(jìn)了Endo-Om的表達(dá)（對(duì)應(yīng)的目的蛋白質(zhì)條帶約91 000），但是大量目的條帶被降解。相比較而言，雖帶有質(zhì)粒pLysS的BL21（DE3）菌株也存在著蛋白質(zhì)被降解的現(xiàn)象，但降解比例相對(duì)較低。同時(shí)其表達(dá)的Endo-Om的量明顯多于BL21（DE3）菌株，只通過考馬斯亮藍(lán)染色就可以確認(rèn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)。值得一提的是，在沒有IPTG誘導(dǎo)下，BL21（DE3）仍然表達(dá)了許多目的蛋白質(zhì)，這可能是因?yàn)橛猩倭康膌acUV5啟動(dòng)了T7RNA聚合酶，存在著目的蛋白質(zhì)的本底表達(dá)。而加入質(zhì)粒pLysS之后，由于其含有T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶可以與T7RNA聚合酶結(jié)合，從而可以降低目的基因的背景表達(dá)水平。

圖1 SDS-PAGE和Western-blotting分析IPTG誘導(dǎo)重組Endo-Om的蛋白質(zhì)表達(dá)Fig.1 Expression of recombinant Endo-Om by IPTG induction in various hosts

超聲破碎宿主菌 BL21（DE3）pLysS，取其離心后的上清液及沉淀進(jìn)行Western blotting。從圖2可以看出，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，雖然大量表達(dá)了Endo-Om，但其幾乎全部出現(xiàn)在沉淀中。說明Endo-Om在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)易被蛋白酶降解并且極易形成包涵體。

圖 2 Western-blotting分析 Endo-Om 在 BL21（DE3）pLysS中的表達(dá)Fig.2 Western blotting analysis of the expression of recombinant Endo-Om in BL21（DE3）pLysS

2.2 重組蛋白在大腸桿菌BL21（DE3）pLysS的可溶性表達(dá)及活性檢測(cè)

為了促進(jìn)Endo-Om在大腸桿菌中可溶性表達(dá)，我們對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。當(dāng)其在O/N instant LB中16℃培養(yǎng)48 h后，取細(xì)胞液做western blotting分析。圖3（a）顯示了在這種培養(yǎng)條件下，Endo-Om蛋白質(zhì)的降解明顯地降低。同時(shí)破碎細(xì)胞后，分別取等量的上清液與沉淀進(jìn)行Western blotting。圖3（b）可以明顯地看出，與之前IPTG誘導(dǎo)表達(dá)使得幾乎全部重組蛋白質(zhì)形成包涵體不同，約占1/4的蛋白質(zhì)表達(dá)到上清液里，而且大部分的降解出現(xiàn)在沉淀中。Endo-Om在O/N instant LB中低溫培養(yǎng)不僅可以減少蛋白質(zhì)的降解還可促進(jìn)其可溶性表達(dá)。在低溫的培養(yǎng)條件下，菌體生長(zhǎng)速度、代謝速度減緩，使其有更充足的時(shí)間進(jìn)行蛋白質(zhì)的組裝，幫助外源蛋白質(zhì)折疊[13]。

已知Endo-Om具有糖苷水解酶的活性，因此我們以NGA2-Asn-Fmoc為底物，以水為空白對(duì)照，測(cè)重組大腸桿菌粗酶液的活性，見圖4（a）。從圖4（b）看出，隨著 NGA2-Asn-Fmoc 的峰（約 16 min）的降低，酶切產(chǎn)物的峰（約在 11 min）出現(xiàn)，即產(chǎn)物GlcNAc-Asn-Fmoc。因而，可溶性表達(dá)到大腸桿菌上清液里的Endo-Om是有活性的。

圖3 Western blotting分析重組的Endo-Om 16℃在O/N instant LB培養(yǎng)基中的表達(dá)Fig.3 Expression of recombinant Endo-Om in O/N instant LB medium at 16℃

2.3 重組蛋白的純化及活性鑒定

重組大腸桿菌超聲破碎后，離心收集上清液，利用鎳親和層析柱HisTrpTM HP純化。首先用200 mmol/L的咪唑洗去非特異性結(jié)合的雜蛋白質(zhì)，然后，以500 mmol/L的咪唑洗脫目的蛋白質(zhì)，SDSPAGE分析

純化得到的蛋白質(zhì)。從圖5可以清楚的看到，在約90 000處有一條清晰的主條帶，與預(yù)期的大小一致，成功實(shí)現(xiàn)了Endo-Om在大腸桿菌中的純化。

圖5SDS-PAGE分析純化的重組Endo-OmFig.5 SDS-PAGE of purified Endo-Om

以NGA2-Asn-Fmoc為底物，我們檢測(cè)純化后蛋白質(zhì)的活性，圖6顯示純化后的Endo-Om具有糖苷水解酶活性，可以水解N-糖鏈中兩個(gè)GlcNAc之間的β-1-4糖苷鍵，釋放N-糖鏈和帶有GlcNAc的多肽。計(jì)算大腸桿菌中純化的Endo-Om的比活力為7.68 U/g，與Murakami等從Ogataeaminuta酵母中純化出的酶的比活力9.92 U/g[12]相比，并無較大的差別。酶活單位定義為在此反應(yīng)條件下，每分鐘生成1 μmol的GlcNAc-Asn-Fmoc所需的酶量。

圖6HPLC檢測(cè)純化后Endo-Om水解活性Fig.6 HPLC analysis of hydrolysis activity of purified Endo-Om

3 結(jié)語(yǔ)

糖鏈結(jié)構(gòu)和功能的研究及糖蛋白藥物、疫苗等都迫切需要帶有均一糖鏈的糖蛋白和糖肽，化學(xué)酶合成法，尤其是利用ENGase的轉(zhuǎn)糖基活性合成此類糖蛋白和糖肽成為了目前研究的熱點(diǎn)[3]。Endo-M和Endo-A都已多次被應(yīng)用，但存在著局限性[14]。最近，有研究報(bào)道來源于Ogataea minuta的內(nèi)切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶（Endo-Om）從屬于GH85家族，可識(shí)別高甘露糖型和復(fù)合型糖鏈。因此，Endo-Om具有較為廣泛的應(yīng)用。Murakami等將其在Ogataea minuta中過表達(dá)并進(jìn)行了純化，但較難得到大量的純酶。我們研究了Endo-Om在大腸桿菌中可溶性表達(dá)，并成功檢測(cè)到純化后的酶液對(duì)缺少半乳糖的雙天線復(fù)合型糖鏈的水解活性。與從其本身酵母中純化的酶的比活力相比較，并無較大的區(qū)別，但眾所周知，大腸桿菌的異源表達(dá)易產(chǎn)生包涵體，本研究雖通過條件的優(yōu)化，得到了可溶性的Endo-Om，但其在 BL21（DE3）pLysS 中依舊形成了部分的包涵體，仍需繼續(xù)研究。值得一提的是，在大腸桿菌中表達(dá)該酶，操作簡(jiǎn)單，我們可利用此法純化該酶，用于其結(jié)構(gòu)及功能的研究。同時(shí)接下來我們還需進(jìn)一步研究Endo-Om的底物識(shí)別機(jī)制，水解和轉(zhuǎn)糖基兩種作用的催化機(jī)理，以期獲得更高效的轉(zhuǎn)糖基突變體，用于合成同源糖蛋白或糖肽。