澳洲堅(jiān)果蛋白夾心ELISA方法的建立及應(yīng)用

賈增艷 王曉敏 沙志聰 周柔柔 生 威 張 燕

(1. 食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室﹝天津科技大學(xué)﹞，天津 300457；2. 天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；3. 天津市食品科學(xué)與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室﹝南開大學(xué)﹞，天津 300071；4. 南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津 300071)

堅(jiān)果是八大類過敏原之一，其中澳洲堅(jiān)果營養(yǎng)豐富，臨床試驗(yàn)[1-2]表明，天然澳洲堅(jiān)果、經(jīng)烘焙加工的澳洲堅(jiān)果都會引起患者不同程度的過敏反應(yīng)，出現(xiàn)全身瘙癢、眼睛、嘴唇腫脹呼吸困難甚至?xí)炟实劝Y狀。Ekbote等[3]對過敏患者進(jìn)行皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)(SPT)發(fā)現(xiàn)，澳洲堅(jiān)果中可能存在一種分子量約為17 kDa的主要過敏原；Herbst等[4]通過免疫印跡分析，報道了澳洲堅(jiān)果中另2種過敏原蛋白，其分子量分別在12，45 kDa左右。過敏原的有效檢測是避免易致敏人群誤食過敏原的有效手段之一，當(dāng)前研究最多、應(yīng)用最廣泛的檢測方法是基于蛋白過敏原的酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)[5]和基于DNA的PCR檢測法[6-7]。Brezna等[8]建立了一種實(shí)時PCR方法，用于檢測食品中的澳洲堅(jiān)果，檢測限為1.45 pg/mL，并通過14種樣品驗(yàn)證PCR方法的實(shí)際適用性，此方法能夠靈敏地檢測食物樣品中的澳洲堅(jiān)果，但并未報道是否適用于熱加工后的堅(jiān)果中過敏原的檢測。經(jīng)過熱加工后食物中的DNA會受損難以提取，極易造成PCR檢測結(jié)果的假陰性，因此PCR法檢測食物中過敏原會對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響[9]。熱處理會使蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化從而對與抗體的結(jié)合造成不同程度的影響。因此，基于抗原抗體特異性結(jié)合原理建立的ELISA方法應(yīng)用于熱加工食品中過敏原蛋白的檢測也存在檢測適用性的難題。Maleki等[10]研究表明焙烤花生比生花生過敏原與IgE有更強(qiáng)的結(jié)合能力。劉珂等[11]研究表明加熱使得OVT、OVA、OVM蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，相比于未處理蛋白，與抗體結(jié)合能力減弱。不同的過敏原蛋白熱穩(wěn)定性不同，對澳洲堅(jiān)果蛋白在經(jīng)過熱加工后的結(jié)構(gòu)變化及過敏原的定量檢測尚未有報道。本研究擬針對澳洲堅(jiān)果蛋白制備多克隆抗體，建立雙抗夾心ELISA方法，并對該方法應(yīng)用于熱加工后的澳洲堅(jiān)果及焙烤食品中的澳洲堅(jiān)果蛋白的定量檢測進(jìn)行評價，以期為加工食品中澳洲堅(jiān)果過敏原的檢測提供有效方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

澳洲堅(jiān)果(Macadamia integrifolia)：HAEA294，云南江城中澳農(nóng)業(yè)科技發(fā)展公司；

大豆、核桃、榛果、杏仁、花生、開心果、腰果和小麥：市售；

免疫動物：3月齡雄性新西蘭白兔、6～7周齡雌性BALB/c小鼠，中國食品藥品檢定研究所；

弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、牛血清白蛋白(BSA)、羊抗兔IgG-HRP、羊抗鼠IgG-HRP、Tris、甘氨酸、BCA蛋白定量試劑盒、十二烷基磺酸鈉(SDS)、過氧化氫脲(CH6N2O3)、3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、脫脂乳粉、魚皮膠、明膠、酶標(biāo)穩(wěn)定劑：含量≥99%，美國Sigma公司；

Tween 20：化學(xué)純，海浦東化工試劑廠；

β-環(huán)糊精、二甲基亞砜(DMSO)：化學(xué)純，德國Merck公司；

預(yù)制膠：12%，美國Bio-Rad公司；

其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

免疫親合層析柱：Protein A-Sepharose 4B、Protein G-Sepharose 4B型，美國Amersham公司；

蛋白純化儀：731-8300型，美國BIO-RAD公司；

酶標(biāo)儀：F200 PRO型，美國Thermo公司；

磁力攪拌器：RH-KT型，德國IKA公司。

1.2 方法

1.2.1 澳洲堅(jiān)果蛋白的制備與驗(yàn)證

(1) 除脂：將無殼生澳洲堅(jiān)果仁充分研磨，用料液比為1∶20 (g/mL)的正己烷室溫下攪拌浸提16 h，經(jīng)過0.45 μm 有機(jī)系纖維素膜過濾，收集果粉重復(fù)上述操作，揮發(fā)殘留的正己烷。將得到的堅(jiān)果粉過50目篩，真空包裝后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2) 提?。翰捎谜和槊撝A提取(MAPI)方法提取澳洲堅(jiān)果蛋白[12]，用去離子水溶解得到的蛋白沉淀冷凍干燥，將得到的蛋白質(zhì)粉在-20 ℃保存?zhèn)溆肹13-15]。

(3) SDS-PAGE：參照Zhang等[16]方法，對制備的澳洲堅(jiān)果蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.2 澳洲堅(jiān)果蛋白的兔多克隆抗體制備 以所制備的澳洲堅(jiān)果蛋白為免疫原對雄性新西蘭白兔進(jìn)行免疫，2周免疫1次。初次免疫的乳化劑使用完全佐劑，免疫劑量1 mg/只，后4次增強(qiáng)免疫選擇不完全佐劑，免疫劑量0.5 mg/只。第2次免疫1周后開始耳部靜脈取血，第5次免疫結(jié)束1周后采股動脈全血，用IC-ELISA法測定血清效價，用Protein A-Sepharose-4B免疫親合層析柱純化獲得抗體[17]。

1.2.3 澳洲堅(jiān)果蛋白鼠多克隆抗體的制備 選擇6～7周齡雌性BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。初次免疫時免疫原與弗氏完全佐劑1∶1體積混合乳化，每隔2周與不完全佐劑混合加強(qiáng)免疫，免疫劑量均為100 μg/只，第5次免疫結(jié)束1周后取全血，Protein G-Sepharose-4B免疫親合層析純化，于-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 澳洲堅(jiān)果蛋白雙抗夾心ELISA檢測步驟 將兔抗澳洲堅(jiān)果蛋白抗體以100 μL/孔包被于96孔酶標(biāo)板上，在4 ℃下孵育12 h后用PBST洗板3次，加封閉液(200 μL/孔)于37 ℃下封閉1 h。用PBST洗板3次，加入梯度稀釋的澳洲堅(jiān)果蛋白溶液(100 μL/孔)，室溫下孵育1 h后PBST洗板4次。加入鼠抗血清(100 μL/孔)，室溫下孵育1 h后用PBST 洗板4次。將HRP標(biāo)記的鼠二抗(100 μL/孔)加到酶標(biāo)板上，室溫反應(yīng)30 min后用PBST洗板5次，加入底物A和B的混合液(100 μL/孔)，37 ℃下顯色(15～20 min)，每孔加入50 μL硫酸終止液后在波長450～650 nm讀取吸光度值。以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值(A450-A650)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢出限(LOD)為A空白平均值±3SD對應(yīng)的蛋白濃度，定量限(LOQ)為A空白平均值±10SD對應(yīng)的蛋白濃度。

1.2.5 雙抗夾心ELISA檢測方法特異性的測定 選擇大豆、核桃、榛果、杏仁、花生、開心果、腰果和小麥8種常見過敏原，采用與澳洲堅(jiān)果蛋白相同的方法制備相應(yīng)的蛋白，采用建立的雙抗夾心ELISA方法進(jìn)行檢測。PBS緩沖液作為陰性對照。樣品孔和陰性對照孔的吸光度值分別用P和N來表示。如果P/N>2，則表明樣品中的蛋白與抗體有交叉反應(yīng)。

1.2.6 雙抗夾心ELISA檢測方法的應(yīng)用 自制餅干，定量添加澳洲堅(jiān)果，同時以不含澳洲堅(jiān)果的餅干為對照，采用本研究建立的蛋白提取方法提取樣品中的澳洲堅(jiān)果蛋白，采用建立的雙抗夾心ELISA方法檢測餅干中澳洲堅(jiān)果過敏原蛋白的含量，按式(1)計算回收率：

(1)

式中：

P——回收率，%；

成立于1997年的廣州松興電氣有限公司主要從事電阻焊機(jī)、自動焊專機(jī)及機(jī)器人焊接系統(tǒng)的開發(fā)、制造、銷售和技術(shù)服務(wù)。近年來，除了不斷完善和發(fā)展電阻焊標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品外，松興公司還致力于各種大型自動焊接設(shè)備、焊接生產(chǎn)線的開發(fā)制造，努力向行業(yè)縱深發(fā)展，先后承接并成功設(shè)計、制造了一大批面向國內(nèi)外知名企業(yè)的自動焊接生產(chǎn)線。

C1——添加澳洲堅(jiān)果蛋白樣品的檢測值，mg；

C0——未添加澳洲堅(jiān)果蛋白樣品的檢測值，mg；

C2——澳洲堅(jiān)果蛋白理論添加值，mg。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)平行測定3次，利用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 22.0對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析(P<0.05)，用Origin 8.0繪制檢測方法的相關(guān)曲線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 澳洲堅(jiān)果蛋白的驗(yàn)證

將所制備的澳洲堅(jiān)果蛋白(1 mg/mL)通過SDS-PAGE分析(圖1)，由圖1可見，澳洲堅(jiān)果蛋白分子量主要分布在15～50 kDa 左右，其中分子量在20，45 kDa左右的蛋白含量較高，與Herbst等[4]研究結(jié)果一致。

M. 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)參照 1. 澳洲堅(jiān)果蛋白

2.2 雙抗夾心ELISA免疫檢測方法的建立

在以澳洲堅(jiān)果蛋白為免疫原制備的兔多克隆抗體和鼠多克隆抗體基礎(chǔ)上，優(yōu)化雙抗夾心ELISA免疫檢測條件。

2.2.1 捕獲抗體及封閉液的選擇 由于夾心ELISA方法檢出限與空白值大小密切相關(guān)，先對捕獲抗體和封閉液進(jìn)行優(yōu)化。將兔抗和鼠抗分別作為捕獲抗體包被于酶標(biāo)板上，1 g/100 mL 的脫脂乳粉、BSA、魚皮膠、明膠、酪蛋白作為封閉液，檢測抗體分別為鼠抗和兔抗，測得空白的吸光度值見表1。

由表1可見，以兔多克隆抗體作為捕獲抗體時，采用不同封閉液的空白吸光度值均低于鼠抗，說明所制備的兔多抗的特異性要好于鼠多抗，以其為捕獲抗體時非特異性吸附較小，因此確定該方法的捕獲抗體為兔多抗，檢測抗體為鼠多抗，可在一定程度上提高檢測方法的靈敏度和特異性。同時，1 g/100 mL脫脂乳粉為封閉液時空白值最小，說明脫脂乳粉對酶標(biāo)板上空余位點(diǎn)的封閉效果最好，且與鼠抗的非特異性吸附最弱，有助于提高檢測的靈敏度。因此選擇脫脂乳粉作為封閉液，并進(jìn)一步優(yōu)化封閉液濃度。

由表2可知0.5 g/100 mL的脫脂乳粉空白值最小，低濃度(0.1 g/100 mL)脫脂乳粉封閉的空白值比0.5 g/100 mL脫脂乳粉的大，可能是封閉液中蛋白濃度小導(dǎo)致未能完全封閉酶標(biāo)板上未被捕獲抗體占據(jù)的空余位點(diǎn)，造成檢測抗體與空余位點(diǎn)結(jié)合的非特異性吸附；1.0 g/100 mL脫脂乳粉空白值最大，可能是濃度大使非特異性吸附增加所致。因此優(yōu)化后的封閉液為濃度0.5 g/100 mL的脫脂乳粉。

表2 不同脫脂乳粉濃度下空白的平均吸光度值

2.2.2 捕獲抗體包被量的優(yōu)化 將兔多克隆抗體作為捕獲抗體，分別稀釋至0.025，0.050，0.100 μg/孔進(jìn)行包被，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。捕獲抗體的包被量對檢測方法的靈敏度有很大影響，捕獲抗體量越多，特異性結(jié)合的過敏原越多，因此會對待檢過敏原起到富集的作用，相應(yīng)提高方法的靈敏度。但捕獲抗體過高，會造成非特異性吸附增加，使空白值增大，又會降低檢測靈敏度。因此捕獲抗體量需要通過試驗(yàn)優(yōu)化確定。結(jié)果表明，包被量為0.050，0.100 μg/孔時空白值相差不大且都具有良好的線性相關(guān)性，同時比0.025 μg/孔包被量在同一濃度蛋白對應(yīng)的檢測吸光度值高，從節(jié)約抗體角度考慮，將捕獲抗體的包被量確定為0.050 μg/孔。

圖2 捕獲抗體包被量對澳洲堅(jiān)果蛋白雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測方法的影響

Figure 2 Effect of coating quantity of capture antibody on macadamia nut protein sandwich ELISA

2.2.3 檢測抗體稀釋倍數(shù)的優(yōu)化 固定優(yōu)化后的捕獲抗體包被量和封閉液，將檢測抗體(鼠多抗)分別按1∶1 000，1∶1 500，1∶2 000，1∶2 500的比例進(jìn)行稀釋，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)。檢測抗體(鼠多抗)除與澳洲堅(jiān)果蛋白過敏原發(fā)生特異性結(jié)合外，當(dāng)其濃度過高時會使非特異性吸附增加造成空白值增大，降低特異性檢測的靈敏度。結(jié)果說明，1 000倍稀釋抗體所得到的空白值最高，而以1 500，2 000，2 500倍稀釋檢測抗體得到的空白值相差不大，以1∶2 000比例進(jìn)行稀釋檢測抗體得到線性相關(guān)性最好，因此檢測抗體的最佳稀釋倍數(shù)確定為2 000。

2.2.4 酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)的優(yōu)化 固定優(yōu)化后的捕獲抗體包被量、封閉液和檢測抗體濃度，用PBS(pH 7.4，0.1 mol/L)緩沖液將羊抗鼠酶標(biāo)二抗按1∶10 000，1∶20 000，1∶30 000 進(jìn)行稀釋，繪制標(biāo)曲，結(jié)果見圖4。羊抗鼠酶標(biāo)二抗能特異性識別檢測抗體鼠多抗，利用二抗上結(jié)合的酶作為整個體系的檢測信號，理論上其濃度越大，催化酶底物產(chǎn)生的信號越強(qiáng)，方法越靈敏，但酶濃度過高時會導(dǎo)致蛋白類物質(zhì)的非特異性結(jié)合，造成酶標(biāo)二抗的非特異性吸附，會降低待測物與檢測信號間的線性相關(guān)性，因此酶標(biāo)二抗?jié)舛鹊膬?yōu)化非常關(guān)鍵。優(yōu)化結(jié)果表明，以1∶20 000，1∶30 000稀釋時R2均接近于1，吸光度值無明顯差異，為節(jié)約抗體，選擇羊抗鼠酶標(biāo)二抗的稀釋倍數(shù)為30 000倍。

圖3 檢測抗體稀釋倍數(shù)對澳洲堅(jiān)果蛋白雙抗夾心ELISA的影響

Figure 3 Effect of detection antibody dilution factor on macadamia nut protein sandwich ELISA

圖4 酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)對澳洲堅(jiān)果蛋白雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測的影響

Figure 4 Effect of dilution factor of enzyme labeled second antibody on macadamia nut protein sandwich ELISA

2.2.5 雙抗夾心ELISA法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 配制系列蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用優(yōu)化的分析條件進(jìn)行檢測，以蛋白濃度作為橫坐標(biāo)，吸光度值作為縱坐標(biāo)繪制雙抗夾心ELISA檢測澳洲堅(jiān)果過敏原蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)，計算得LOD值為 (0.95±0.17) ng/mL，LOQ值為(3.13±0.57) ng/mL。

2.2.6 雙抗夾心ELISA方法的特異性 為評價所建立方法的特異性，將大豆、核桃、榛果、杏仁、花生、開心果、腰果和小麥蛋白用PBS緩沖液分別配制成濃度分別為0.1，1.0，10.0 μg/mL 的蛋白溶液。以PBS緩沖液作為陰性對照，采用建立的澳洲堅(jiān)果蛋白雙抗夾心ELISA方法測定，讀取相應(yīng)的吸光度值，結(jié)果見表3。

圖5 澳洲堅(jiān)果過敏原蛋白雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測方法

表3 雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測方法的特異性

從表3中可以看出，榛果和開心果蛋白與澳洲堅(jiān)果抗體有較弱的結(jié)合反應(yīng)，其他6種過敏原蛋白均無交叉反應(yīng)。說明榛果蛋白和開心果蛋白與澳洲堅(jiān)果蛋白具有相似的結(jié)構(gòu)，與Sutherland 等[18]的研究結(jié)果一致。

2.3 雙抗夾心ELISA檢測方法的檢測穩(wěn)定性

用PBS緩沖液稀釋澳洲堅(jiān)果蛋白，濃度為30.0，16.0，8.0，4.0 ng/mL，以板內(nèi)變異與板間變異對建立的雙抗夾心ELISA進(jìn)行精密度測試。

將4個濃度的蛋白溶液在同一酶標(biāo)板上分別進(jìn)行5個平行測試，計算A450-A650的板內(nèi)變異系數(shù)為3.36%～7.20%。相同條件綜合5 d測得的吸光度值，計算板間變異系數(shù)為3.83%～12.05%，均低于15%，說明該方法具有較好的穩(wěn)定。

2.4 雙抗夾心ELISA方法的應(yīng)用

2.4.1 烘焙加工處理對澳洲堅(jiān)果蛋白提取率的影響 將澳洲堅(jiān)果經(jīng)170 ℃處理20 min，以未處理的生澳洲堅(jiān)果作為對照樣品，探討常見焙烤條件對澳洲堅(jiān)果蛋白提取率的影響，結(jié)果見表5。

澳洲堅(jiān)果經(jīng)170 ℃加熱處理后，蛋白得率顯著降低(P<0.05)，是未加工處理蛋白得率的90%左右，說明熱加工在一定程度上降低了蛋白提取率，可能是加熱改變了蛋白的結(jié)構(gòu)，使蛋白溶解度降低。

2.4.2 餅干中澳洲堅(jiān)果蛋白的測定 自制定量添加澳洲堅(jiān)果的餅干，用堿溶酸沉法提取餅干中的澳洲堅(jiān)果蛋白。用建立的雙抗夾心ELISA法進(jìn)行測定，以未添加澳洲堅(jiān)果的餅干為對照。根據(jù)表5蛋白得率計算澳洲堅(jiān)果蛋白的理論添加量，以及焙烤餅干中可被提取的澳洲堅(jiān)果蛋白的理論含量，按照式(1)分別計算回收率，結(jié)果見表6。

表4 澳洲堅(jiān)果蛋白雙抗夾心ELISA檢測的板內(nèi)及板間變異

表5 焙烤加工處理對蛋白提取率的影響?

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

表6 雙抗夾心ELISA檢測餅干中澳洲堅(jiān)果蛋白的添加回收率

不考慮熱加工處理對澳洲堅(jiān)果蛋白得率的影響，以焙烤后的澳洲堅(jiān)果蛋白理論含量計算，添加回收率為82.07%～85.49%，表明該方法用于澳洲堅(jiān)果蛋白檢測的準(zhǔn)確度較好。以未處理的澳洲堅(jiān)果蛋白的理論添加量計算，添加回收率為73.67%～77.03%，回收率偏低的原因可能是熱加工使部分澳洲堅(jiān)果蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致樣品中蛋白提取率降低，另外空間結(jié)構(gòu)的變化可能導(dǎo)致抗原表位變化，從而與抗體識別力下降，表現(xiàn)為ELISA檢測結(jié)果整體偏低。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通優(yōu)化封閉液、捕獲抗體的包被濃度，檢測抗體、酶標(biāo)二抗的稀釋倍數(shù)，建立了澳洲堅(jiān)果蛋白的雙抗夾心ELISA方法。選用抗體包被量為0.05 μg/孔，封閉液為0.5 g/100 mL 脫脂乳粉，檢測抗體稀釋倍數(shù)為2 000，羊抗鼠HRP-酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)為30 000，方法的最低檢出限為(0.95±0.17) ng/mL，定量限為(3.13±0.57) ng/mL，檢測線性范圍為3.13～30.00 ng/mL。測定結(jié)果的變異系數(shù)<12.05%，說明所建立的澳洲堅(jiān)果蛋白雙抗夾心ELISA方法有良好的特異性與穩(wěn)定性。該法應(yīng)用于焙烤的澳洲堅(jiān)果和餅干中澳洲堅(jiān)果蛋白檢測，回收率較高，說明該方法適用于焙烤食品中澳洲堅(jiān)果蛋白的定量檢測。