鉤狀效應(yīng)對化學(xué)發(fā)光法測定甲胎蛋白的影響與解決方案探討

崔懷中 王 瑩 孫少丹

(杭州市西溪醫(yī)院杭州市第六人民醫(yī)院檢驗科,杭州 310023)

化學(xué)發(fā)光免疫分析(Chemiluminescence immuno-assay，CLIA)是化學(xué)發(fā)光與免疫分析相結(jié)合的一種分析方法。由于它具有靈敏度高、特異性好、分析速度快、操作簡便等優(yōu)點，近年來在臨床診斷等領(lǐng)域中得到了廣泛運用[1]。甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein,AFP)是人類發(fā)現(xiàn)的第一個蛋白類腫瘤標志物，已廣泛應(yīng)用于肝癌的診斷和治療監(jiān)測[2]。鉤狀效應(yīng)即Hook效應(yīng)是指免疫分析中由于抗原抗體比例不合適而導(dǎo)致的假陰性或測定值小于真實值的現(xiàn)象。抗原抗體特異性反應(yīng)時，生成結(jié)合物的量與抗原抗體的比例有關(guān)。無論在一定量的抗體中加入不同量的抗原或在一定量的抗原中加入不同量的抗體，均只有在兩者比例合適時才出現(xiàn)最顯著的抗原抗體反應(yīng)，否則將可能導(dǎo)致測定結(jié)果低于實際結(jié)果[3]。本文報告了使用CLIA測定AFP過程中，由于鉤狀效應(yīng)導(dǎo)致測定結(jié)果遠遠低于實際值的現(xiàn)象，并探討針對該現(xiàn)象的解決方案。

1 資料與方法

1.1資料 2017年6月18日在我院住院治療的患者，男，40歲，臨床診斷為肝惡性腫瘤，核磁共振(MRI)檢查結(jié)果為：“肝臟右葉巨塊型肝癌伴肝內(nèi)彌漫多發(fā)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，門脈內(nèi)廣泛癌栓形成，附見：兩肺彌漫多發(fā)轉(zhuǎn)移瘤”。2017年6月18日至2017年12月31日本院實驗室進行AFP測定的標本39 484份。

1.2實驗方法 抽取受檢者清晨空腹靜脈血約5 ml 于含惰性分離膠的促凝管中，靜置30 min，待標本充分凝固后，4 000 r/min離心10 min后上機檢測。檢測儀器為美國 Beckman-Coulter DxI800全自動化學(xué)發(fā)光分析儀，試劑為原裝配套試劑，批號625284。所有項目檢測前均室內(nèi)質(zhì)控在控，所有操作嚴格按照標準操作說明書進行。

2 結(jié)果

表1對AFP濃度為1154772ng/ml的標本進行梯度稀釋后測定結(jié)果

Tab.1DeterminationofAFPconcentrationof1154772ng/mlaftergradientdilution

Dilution method(serum∶dilution)Relative light unitby instrumentInstrument displayresults(ng/ml)Theoreticalconcentration(ng/ml)1∶117 381 506>3 000577 3862∶117 012 470>3 000769 8483∶115 416 133>3 000866 0794∶115 337 849>3 000923 8185∶115 043 745>3 000962 3106∶114 052 4632 871989 8057∶113 654 4652 7551 010 4268∶113 245 5462 6071 026 464Undiluted12 355 4122 3031 154 772

Note：The method of determination is to dilute the specimen with the above ratio and then use the built-in dilution mode of the instrument.

2.1鉤狀效應(yīng)影響AFP測定結(jié)果的發(fā)現(xiàn)過程及處理措施 該標本醫(yī)生同時開了AFP測定和AFP稀釋測定(儀器預(yù)置的稀釋測定模式，稀釋倍數(shù)為18倍)，儀器測定的結(jié)果分別為2 303 ng/ml和>54 000 ng/ml。由于兩個結(jié)果間存在明顯的邏輯錯誤，因此對該標本進一步進行手工的稀釋測定，經(jīng)500倍稀釋后測得結(jié)果為1 154 772 ng/ml。對于診斷為肝惡性腫瘤的患者來說，AFP測定結(jié)果為2 303 ng/ml是完全可能的結(jié)果，可見如果該標本醫(yī)生沒有同時開AFP稀釋測定，實驗室將很有可能報告出一個錯誤的結(jié)果。為避免可能錯誤的發(fā)生，通過和儀器廠家工程師的溝通，我實驗室決定將此后AFP>2 000 ng/ml 的標本全部在儀器上進行稀釋模式復(fù)測。從2017年6月18日至2017年12月31日本院實驗室共測定AFP標本39 484份，其中大于2 000 ng/ml標本200份，144份標本儀器直接給出了>3 000 ng/ml的結(jié)果。對其他56份儀器測定結(jié)果為2 000 ng/ml以上的標本,經(jīng)稀釋復(fù)測后發(fā)現(xiàn)由于鉤狀效應(yīng)而導(dǎo)致的錯誤結(jié)果標本。期間對儀器測定結(jié)果為1 000～2 000 ng/ml的標本，由于此結(jié)果段內(nèi)標本數(shù)量較多，采用隨機抽取的方式抽取了100份標本進行稀釋復(fù)測，未發(fā)現(xiàn)由于鉤狀效應(yīng)而導(dǎo)致的錯誤結(jié)果。

2.2對高濃度標本進行梯度稀釋后測定結(jié)果 對AFP濃度為1 154 772 ng/ml的標本進行梯度稀釋，當血清量與稀釋液量為6∶1時開始出現(xiàn)由于鉤狀效應(yīng)而導(dǎo)致的錯誤結(jié)果，此時稀釋后標本的理論濃度為989 805 ng/ml。

3 討論

鉤狀效應(yīng)可導(dǎo)致測定結(jié)果偏離實際值，如果實驗室人員沒有發(fā)現(xiàn)則可能發(fā)出錯誤的報告而影響到患者的診斷和治療，因此鉤狀效應(yīng)是免疫法測定中必須重視的問題?；瘜W(xué)發(fā)光法作為免疫分析的一種，必然也會存在鉤狀效應(yīng)[4]。DxI800全自動化學(xué)發(fā)光分析儀為避免鉤狀效應(yīng)對測定結(jié)果的影響，當測定時如果儀器測定的相對光單位(Relative light unit,RLU)大于一定的值時，儀器會直接給出>3 000 ng/ml的結(jié)果，而不給出具體的數(shù)值。但是如果AFP濃度過高則可能由于嚴重的鉤狀效應(yīng)使儀器給出一個錯誤的結(jié)果[5]。由于AFP在不同的肝癌患者中可能存在著巨大的差異，因此單從臨床診斷上通常難以發(fā)現(xiàn)錯誤的存在。所以筆者所在實驗室通過對所有測定值>2 000 ng/ml的標本進行稀釋復(fù)測，在39 484份標本中發(fā)現(xiàn)3份標本由于顯著的鉤狀效應(yīng)而得出了錯誤的結(jié)果。雖然所占比例不足萬分之一，但測定結(jié)果與真實結(jié)果相差巨大，如果發(fā)出這樣的錯誤報告很可能對臨床診斷和實驗室聲譽造成巨大影響，因此必須引起重視。在AFP試劑的說明書中提到“達到50 0000 ng/ml時，AFP測定不會表現(xiàn)出鉤狀效應(yīng)”，可見當AFP濃度>500 000 ng/ml時就可能存在鉤狀效應(yīng)，但說明書中并未對AFP濃度極高時儀器可能給出完全錯誤的結(jié)果進行明確的說明。根據(jù)本研究對極高濃度標本進行梯度稀釋測定的結(jié)果，可見當AFP濃度>98 9805 ng/ml時就會由于鉤狀效應(yīng)，儀器給出完全錯誤的結(jié)果。因此筆者所在實驗室采取了對所有測定值>2 000 ng/ml的標本進行稀釋復(fù)測，但目前所采用的>2 000 ng/ml必須稀釋復(fù)測的規(guī)則只是基于本實驗所發(fā)現(xiàn)的由于鉤狀效應(yīng)導(dǎo)致錯誤結(jié)果時儀器給出的結(jié)果均在2 000 ng/ml以上而定的，并無明確的理論依據(jù)。對于儀器測定值在2 000 ng/ml以下的標本，本實驗室進行部分標本的抽樣稀釋復(fù)測中，未發(fā)現(xiàn)鉤狀效應(yīng)的存在，但不能排除儀器測定結(jié)果為2 000 ng/ml 以下時存在鉤狀效應(yīng)的可能。因此還需要儀器生產(chǎn)商進一步改進儀器和試劑性能來避免此類錯誤的發(fā)生。

AFP是目前應(yīng)用最廣泛的診斷原發(fā)性肝癌的腫瘤標志物，是臨床公認的肝細胞肝癌診斷最敏感標志物之一，其不僅在篩查和診斷中起重要作用，同時對原發(fā)性肝癌患者的預(yù)后判斷和治療監(jiān)測也起重要的作用[6,7]。其檢測結(jié)果一直受到臨床醫(yī)生和患者的高度重視，其檢測結(jié)果的穩(wěn)定性和準確性與患者的治療方案緊密相關(guān)，低于真實值的結(jié)果會給臨床醫(yī)生或患者錯誤的提示，延誤治療或影響療效判斷。因此，作為檢驗工作者必須要加強責(zé)任心，充分認識到儀器可能存在的局限性以及鉤狀效應(yīng)可能對結(jié)果產(chǎn)生的嚴重影響。對可疑的結(jié)果要及時跟臨床醫(yī)生進行溝通并結(jié)合患者的病情及其他檢查結(jié)果綜合分析、討論，必要時對標本進行復(fù)測或稀釋后復(fù)測避免因鉤狀效應(yīng)或其他原因?qū)е聶z驗結(jié)果的錯報。