環(huán)境暴露在過敏性疾病中的重要作用

林新鎏，鄭振宇，任 霞，楊朝崴，蘇 鐘，李 靖

1 過敏性疾病患病率流行趨勢

1.1 過敏性疾病全國流行趨勢

在過去30年里，哮喘等過敏性疾病的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢[1]。中國哮喘和過敏的患病率也逐年增長，廣州呼吸健康研究院于1994年至2010年采用ISAAC問卷調(diào)查方案，發(fā)現(xiàn)廣州市兒童哮喘和過敏性鼻炎患病率從1994年的3.9%和17.4%上升到2001年的4.6%和22.4%，再上升至2009年的6.9%和25.1%[2]。1990年、2000年、2010年開展的全國內(nèi)陸城市兒童哮喘流行病學(xué)研究也顯示，一些大城市的哮喘患病率持續(xù)上升，例如北京地區(qū)兒童的患病率分別為0.77%、2.05%和2.55%，上海地區(qū)的患病率分別為1.50%、3.34%和5.73%[3-5]。

1.2 過敏性疾病城鄉(xiāng)發(fā)病率差異

與經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)過敏性疾病患病率顯著升高不同，在部分缺乏城市化進(jìn)程的環(huán)境下人群患病率較低。已報道的兩種典型的保護(hù)性環(huán)境包括，歐洲農(nóng)場環(huán)境和農(nóng)村環(huán)境，這兩種環(huán)境下人群患病率保持較低的患病率[6-7]。Stein等[8]比較各30 例匹配的分別來自傳統(tǒng)農(nóng)場環(huán)境的Amish兒童和現(xiàn)代化農(nóng)場環(huán)境的Hutterite 兒童，雖然兩者有著相似的遺傳背景和生活方式，但Hutterite人群的哮喘和過敏性疾病患病率分別是Amish人群的4倍和6倍，而Amish家居灰塵中的內(nèi)毒素水平卻是后者的6.8倍。課題組對廣州市區(qū)和從化農(nóng)村的13～14歲兒童過敏性疾病進(jìn)行對比研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)農(nóng)村兒童的哮喘患病率顯著低于城市兒童(3.4%vs. 6.9%)，過敏性鼻炎和濕疹患病率也發(fā)現(xiàn)相似的城鄉(xiāng)差異[9]。與中國南方地區(qū)類似，北京周邊農(nóng)村地區(qū)兒童哮喘患病率亦顯著低于北京市區(qū)兒童(1.1%vs. 6.3%)[6]。

西方發(fā)達(dá)國家的食物過敏患病率持續(xù)升高，但地區(qū)間差異顯著。最近一項薈萃分析顯示，歐洲17歲以下兒童自我報告的食物過敏患病率為6.9%；當(dāng)結(jié)合sIgE陽性結(jié)果時，患病率降至3.6%[10]。亞洲地區(qū)兒童和西方國家的食物過敏患病率差異很大。在泰國北部地區(qū)，家長自我報告的食物過敏患病率為9.3%，通過食物激發(fā)試驗明確的患病率為1.1%[11]。課題組采用歐洲Europrevall-INCO標(biāo)準(zhǔn)化問卷，對廣州城市和韶關(guān)農(nóng)村5～15歲學(xué)齡兒童進(jìn)行橫斷面調(diào)查研究，結(jié)果兩地自我報告的食物過敏(3.7%)和IgE介導(dǎo)的食物過敏(0.3%)的患病率均很低，且城鄉(xiāng)之間沒有顯著性差異(0.36%vs. 0.30%，P=0.586)。而最近Botha等[12]首次對由食物激發(fā)試驗診斷的食物過敏進(jìn)行城鄉(xiāng)比較，顯示南非農(nóng)村人口的食物過敏患病率和致敏率都比較低。這提示食物過敏在亞洲的模式特征可能有別于西方國家，還需要進(jìn)一步探討。

2 過敏原致敏情況

2.1 吸入性過敏原

塵螨是中國南方地區(qū)最常見的吸入性過敏原。其他常見的吸入過敏原包括蟑螂、貓毛和狗毛等。國內(nèi)研究顯示，分別有59.0%、57.6%和40.7%的過敏患者對粉塵螨(Der-f)、屋塵螨(Der-p)以及熱帶螨過敏[13]。課題組的數(shù)據(jù)顯示，Der-f、Der-p致敏兒童的喘息患病率分別從2001年的14.4%、15.3%上升到2009年的30.9%、33.1%。同時，對塵螨致敏兒童的喘息患病率顯著高于非致敏兒童[2]。2002年廣州兒童對Der-p、Der-f、貓毛和混合草花粉等過敏原的致敏率分別為41.7%、42.7%、4.7%和0.5%，到2010年顯著增加(分別為55.0%、55.0%、17.1%和3.7%)。與此相反，蟑螂致敏率從2002年的16.0%下降到2010年的7.6%[2]。筆者一項針對中國鼻炎伴或不伴哮喘患者的多中心研究顯示，美洲大蠊和德國小蠊的致敏率分別為26.34%和19.37%，盡管致敏患者對蟑螂暴露的皮膚反應(yīng)較輕，但蟑螂的致敏性與哮喘的患病率之間存在顯著相關(guān)性[14]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，韶關(guān)農(nóng)村地區(qū)蟑螂過敏原致敏率顯著高于廣州城市[15]。我國北方地區(qū)，Wang等[16]調(diào)查內(nèi)蒙古地區(qū)過敏性鼻炎患病率為32.4%，其中半數(shù)以上為花粉癥相關(guān)過敏性鼻炎，其患病率高達(dá)18.5%。

2.2 食物過敏原

大量的研究數(shù)據(jù)顯示，食物過敏非常常見，其患病率呈上升趨勢，且存在地域差異。國內(nèi)重慶地區(qū)有一單中心橫斷面兒童食物過敏的報道，從1999年到2009年，食物過敏患病率從3.5%上升到了7.7%[17]。本課題組在城鄉(xiāng)食物過敏研究的后續(xù)病例對照研究中發(fā)現(xiàn)，韶關(guān)農(nóng)村兒童皮膚點(diǎn)刺試驗(30.2%vs. 9.7%)與血清sIgE(48.8%vs. 31.0%)檢出的食物過敏原陽性率(致敏率)均顯著高于廣州市區(qū)。進(jìn)食蝦、蟹是導(dǎo)致廣州和韶關(guān)地區(qū)學(xué)齡兒童食物過敏的主要原因。但農(nóng)村兒童的食物過敏患病率很低，兩者之間存在分離，其原因仍需要進(jìn)一步的研究驗證。

3 危險因素及微生物暴露

3.1 過敏性疾病危險因素

哮喘發(fā)病機(jī)制為多因素性，其發(fā)病危險因素中最重要的是遺傳和環(huán)境因素，由于遺傳背景不可能在短短數(shù)十年內(nèi)發(fā)生顯著變化，所以環(huán)境因素可能是該病的決定因素。1989年，Strachan[18]首次提出衛(wèi)生假說，認(rèn)為人類過敏性疾病和自身免疫疾病的迅速上升要?dú)w因于太過干凈的環(huán)境，但環(huán)境中起重要作用的暴露因子尚不清楚。在隨后近30年間，國際多個團(tuán)隊對兒童哮喘患病率與環(huán)境暴露因素進(jìn)行相關(guān)分析并探討可能的分子機(jī)制[19]。Braun-Fahrlander等[20]在1999年首次發(fā)現(xiàn)農(nóng)場長大的兒童發(fā)展為過敏體質(zhì)及過敏性疾病的概率顯著低于非農(nóng)場兒童。隨后多項系列研究,包括歐洲農(nóng)場環(huán)境[21-23]、美國Amish傳統(tǒng)農(nóng)場及Hutterite現(xiàn)代農(nóng)場環(huán)境[8]及城市和農(nóng)村的對比研究[9,24-26]，均驗證了農(nóng)場環(huán)境的保護(hù)作用，稱為“農(nóng)場效應(yīng)”[27]。三種環(huán)境的共性表現(xiàn)是，生命早期暴露于農(nóng)場環(huán)境(尤其是傳統(tǒng)農(nóng)場)或農(nóng)村環(huán)境的人群，過敏性疾病的患病率顯著低于缺乏相關(guān)保護(hù)性暴露因子的人群。由于環(huán)境的多樣性，不同研究發(fā)現(xiàn)的保護(hù)性環(huán)境因子并不完全相同，可能的因子包括接觸農(nóng)場牲畜、農(nóng)作物[21]、未消毒牛奶[28-30]、母乳喂養(yǎng)[26]、農(nóng)場或農(nóng)村耕種活動[9,31]等。

在ISAAC國際多中心研究框架下，通過使用標(biāo)準(zhǔn)化的流行病學(xué)調(diào)查問卷，本課題組系列研究[9]及首都兒科研究所[6]等相關(guān)研究均確認(rèn)了中國南方和北方農(nóng)村環(huán)境的保護(hù)作用。本課題組對廣東省的廣州市區(qū)和從化農(nóng)村的調(diào)查研究，顯示農(nóng)村的種植環(huán)境和家居粉塵的內(nèi)毒素水平成為從化兒童哮喘發(fā)病的保護(hù)因素[9]。而Kim等[32]則發(fā)現(xiàn)，中國部分農(nóng)村人群存在低過敏性疾病患病率但高過敏體質(zhì)的分離現(xiàn)象，其原因尚不清楚，部分原因可能在于過敏原的交叉反應(yīng)性，例如中國南方農(nóng)村蝦致敏兒童可能是由蟑螂過敏造成[33]。

3.2 微生物組分、種類及多樣性

內(nèi)毒素及微生物暴露可能是不同環(huán)境暴露作用的共有關(guān)鍵因子之一。農(nóng)場及農(nóng)村環(huán)境存在高水平內(nèi)毒素暴露，其與低過敏性疾病患病率相關(guān)[34-36]。2015年，發(fā)表在Science雜志的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素的保護(hù)作用可能與誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞中A20表達(dá)上調(diào)有關(guān)[37]。2016年，NEnglJMed雜志發(fā)表的一項研究發(fā)現(xiàn)，Amish傳統(tǒng)農(nóng)場內(nèi)毒素含量是Hutterite現(xiàn)代農(nóng)場的6.8倍，可調(diào)節(jié)兒童固有免疫通路進(jìn)而預(yù)防過敏性疾病的發(fā)生。除內(nèi)毒素的調(diào)節(jié)作用外，多種微生物相關(guān)模式識別分子(PAMP)，包括胞外多糖(extracellular polysaccharides，EPS)、胞壁酸(muramic acid)、β-葡聚糖(glucans)等與農(nóng)場保護(hù)效應(yīng)密切相關(guān)[38]。此外，Debarry 等[39]從農(nóng)場環(huán)境中篩選出兩種細(xì)菌(Acinetobacter lwoffii與Lactococcus lactis)可誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化，介導(dǎo)過敏保護(hù)作用。Ege 等[40]首次報道屋塵中細(xì)菌和真菌多樣性與暴露兒童哮喘發(fā)病率顯著負(fù)相關(guān)，為環(huán)境保護(hù)效應(yīng)提出新假說。

4 環(huán)境因素與過敏性疾病免疫學(xué)調(diào)控

過敏性疾病患病率的急劇增加與環(huán)境變化之間的關(guān)系尚認(rèn)識不足，但通常認(rèn)為和衛(wèi)生假說有關(guān)[18]。近年來已逐漸明確過敏性疾病作為一種異質(zhì)性疾病，具有不同致病機(jī)制，固有免疫及獲得性免疫均參與其中。誘發(fā)因素包括過敏原暴露、微生物感染、氧化應(yīng)激誘導(dǎo)，涉及的細(xì)胞包括嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、Th2細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DC)、中性粒細(xì)胞、NKT細(xì)胞、自然輔助細(xì)胞、上皮細(xì)胞、Th17細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等[41]。

4.1 固有免疫機(jī)制

人類進(jìn)化過程中，伴隨著與周圍病原體相互作用或共生，如某些腸道和呼吸道菌群與寄生蟲等廣泛存在病原相關(guān)分子模式(PAMP)，可通過結(jié)合宿主DC等固有免疫細(xì)胞表達(dá)的多種模式識別受體(PRR)，如Toll樣受體(TLR)，從而產(chǎn)生免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)場暴露兒童與非暴露兒童相比，其CD14/TLR2表達(dá)水平升高，表明生命早期農(nóng)場環(huán)境暴露通過TLR受體等通路對過敏性疾病起重要調(diào)控作用[42]。隨后的研究表明，母親產(chǎn)前暴露在富含微生物環(huán)境中能使后代TLR2/TLR4/CD14固有免疫系統(tǒng)受體上調(diào)，其機(jī)制可能與宮內(nèi)環(huán)境或表觀遺傳改變有關(guān)，有待進(jìn)一步闡明[43]。TLRs被認(rèn)為是免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的關(guān)鍵系統(tǒng)，上皮細(xì)胞和DC在連接先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用。早期暴露于內(nèi)毒素(LPS)會減弱產(chǎn)生過敏性細(xì)胞因子所需信號通路，但會保留dsRNA/DCs通路，從而激活DCs產(chǎn)生更多Th1細(xì)胞因子。此外，LPS暴露增加鋅脂蛋白A20合成[44]，從而抑制氣道上皮對屋塵螨的過敏反應(yīng)[45]。一項前瞻性研究表明，母親產(chǎn)前接觸農(nóng)場動物，其后代臍帶血TLR5、TLR9明顯升高，且特應(yīng)性皮炎患病風(fēng)險明顯下降[46]。如前述及Stein等[8]比較各30 例Amish 兒童和Hutterite 兒童外周血白細(xì)胞的組成和表型，結(jié)果Amish兒童嗜酸性粒細(xì)胞比例降低，單核細(xì)胞表現(xiàn)出抑制表型(HLA-DR低水平、ILT3高水平)。且Amish灰塵提取物對哮喘動物模型有明顯保護(hù)作用，在缺乏MyD88的小鼠中，此保護(hù)作用急劇下降，而在缺乏MyD88和TRIF的小鼠，此保護(hù)作用被完全廢除，而這兩種分子位于多條固有免疫信號通路的匯聚點(diǎn)，因此，提示農(nóng)場環(huán)境通過固有免疫發(fā)揮對過敏性疾病的保護(hù)作用。

目前已知，環(huán)境中除內(nèi)毒素外，尚有大量其他類型微生物產(chǎn)物，它們共同組成固有免疫系統(tǒng)的有效刺激物[47-48]。iNKT細(xì)胞能識別糖脂類抗原，部分PAMP可不經(jīng)TLR直接激活iNKT細(xì)胞。屋塵提取物(HDE)能通過iNKT細(xì)胞，促進(jìn)OVA誘導(dǎo)哮喘小鼠氣道炎癥，但尚未找到HDE中iNKT相關(guān)抗原來源[49]。然而，有研究發(fā)現(xiàn)乳鼠感染甲流可以保護(hù)成年鼠免受過敏原誘導(dǎo)AHR，這與肺內(nèi)DN CD38亞群在NKT細(xì)胞優(yōu)勢擴(kuò)展有關(guān)，并首次提出富集的DN、T-bet-依賴性、分泌γ-干擾素的NKT細(xì)胞亞群能強(qiáng)有力地抑制AHR的發(fā)展[50]。2019年，有學(xué)者提出早期/新生兒期感染或抗原刺激可通過肺部NKT細(xì)胞的某些亞群如CD38hiDN NKT細(xì)胞，產(chǎn)生IFN-γ，而非IL-17、IL-4或IL-13，并且首次證明這些亞群能直接接觸抑制CD4+T細(xì)胞增殖，從而阻止過敏原誘導(dǎo)的AHR[51]?？傊甆KT細(xì)胞不同亞群在過敏性疾病中通過不同機(jī)制，執(zhí)行不同功能，值得進(jìn)一步深入研究。

4.2 獲得性免疫機(jī)制

2000年，Gereda等[52]在Lancet發(fā)表的研究提供直接證據(jù)，表明持續(xù)環(huán)境內(nèi)毒素暴露能誘導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng)，從而降低對過敏原的敏感度，并促進(jìn)T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，使Th1/Th2平衡，保護(hù)嬰兒免受過敏原致敏。

Treg細(xì)胞在過敏性疾病發(fā)病機(jī)制中的致敏階段發(fā)揮核心作用，在平衡T細(xì)胞分化和成熟過程中發(fā)揮重要功能。所有的Th細(xì)胞，包括Th1、Th2、Th17細(xì)胞的功能受Treg調(diào)節(jié)，在過敏性疾病的免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用[53]。隨著近年來對Treg細(xì)胞研究進(jìn)展，越來越多關(guān)于環(huán)境微生物等暴露與Treg分化發(fā)育的相關(guān)性被報道。McGuirk等[54]和Wilson[55]分別報道了細(xì)菌等病原體和線蟲感染有利于Treg細(xì)胞的發(fā)育。2009年Schaub等[56]研究發(fā)現(xiàn)，母親農(nóng)場暴露可以調(diào)節(jié)后代的免疫系統(tǒng)，新生兒臍帶血Treg數(shù)量和功能提高，Th2相關(guān)淋巴細(xì)胞增殖減少，Th2細(xì)胞因子下降。此外，攝入農(nóng)場牛奶的母親，其后代FOXP3去甲基化增加。并且在農(nóng)場暴露母親的后代，兒童期及成年期過敏性疾病風(fēng)險下降。2015年Lluis等[57]報道，在4.5歲兒童中，農(nóng)場牛乳暴露通過Treg細(xì)胞數(shù)量增加、誘導(dǎo)調(diào)節(jié)表型起保護(hù)作用。

5 小鼠動物模型與過敏性哮喘

利用動物模型研究過敏性哮喘的免疫學(xué)機(jī)制、尋求新的防治手段具有重要意義。近年來，多項動物實驗表明，病原微生物感染，甚至暴露于滅活致病微生物或其中某些單一成分，都能對過敏性疾病的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響[58]。建立反應(yīng)不同保護(hù)性環(huán)境暴露的小鼠模型對于探討保護(hù)性環(huán)境因子及其分子調(diào)控機(jī)制具有重要價值。

5.1 過敏性哮喘研究中常用小鼠模型

誘導(dǎo)小鼠過敏性哮喘一般包括致敏和激發(fā)兩個階段：先以特定過敏原使小鼠全身致敏，后續(xù)以相同的過敏原進(jìn)行氣道激發(fā)。多數(shù)研究使用卵白蛋白OVA作為過敏原進(jìn)行致敏和激發(fā)，少數(shù)用屋塵螨[59]。激發(fā)后，48 h內(nèi)，將小鼠暴露在濃度逐漸增加的乙酰甲膽堿中，測定小鼠氣道阻力的變化[60]。

5.2 小鼠屋塵暴露模型與過敏性哮喘

由于兒童每天有較長時間在臥室度過，其臥室屋塵可在一定程度上反應(yīng)環(huán)境暴露情況。利用不同來源屋塵提取物，建立低劑量持續(xù)暴露的小鼠模型，可反應(yīng)環(huán)境暴露對小鼠的綜合免疫調(diào)節(jié)作用。該模型比單純使用內(nèi)毒素等單體的模型更能反應(yīng)環(huán)境暴露的綜合作用。屋塵暴露的來源大致可分為城市和農(nóng)村兩種。類型可包括牛棚、馬棚、雞舍灰塵，以及有否動物暴露的家居屋塵等。屋塵暴露途徑包括滴鼻和壓縮泵霧化。多項研究表明，每日持續(xù)低劑量暴露可減輕氣道炎癥，而每周大劑量暴露可加重氣道炎癥[61-62]。

5.3 寄生蟲感染模型與過敏性哮喘

寄生蟲感染小鼠模型在過敏性疾病研究中已有大量報道。在曼氏血吸蟲感染的小鼠模型中，母鼠在感染的Th1期或調(diào)節(jié)階段交配，后代小鼠對OVA激發(fā)的氣道反應(yīng)顯著降低[63-64]。寄生蟲可通過分泌免疫調(diào)節(jié)分子調(diào)控免疫系統(tǒng)。例如Severine等已經(jīng)鑒定了鉤蟲、鞭蟲等可分別分泌AIP-2、P43，AIP-2通過抑制DCs上的共刺激表達(dá)及室內(nèi)塵螨過敏患者T細(xì)胞的體外增殖，P43通過結(jié)合IL-13，抑制Th2應(yīng)答[65-66]。然而并非所有寄生蟲感染都具有保護(hù)作用，通常發(fā)生在生命早期和一些慢性感染具有保護(hù)作用；而低負(fù)擔(dān)群體和一些偶發(fā)性急性感染會增強(qiáng)過敏反應(yīng)[67]。

本課題組建立了小鼠腸道多形螺旋線蟲感染模型，該模型可產(chǎn)生較強(qiáng)的Th2型免疫反應(yīng)，并跨器官對肺臟炎癥進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。筆者發(fā)現(xiàn)，IL-10+Breg細(xì)胞通過細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸，顯著促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向IL-10+Treg細(xì)胞方向增殖分化，從而抑制氣道過敏性炎癥[68]。

5.4 小鼠腸道菌群與過敏性哮喘

無菌小鼠缺乏腸道菌群，與傳統(tǒng)小鼠相比其腸道基因表達(dá)、免疫系統(tǒng)發(fā)育不同[69]。無菌小鼠對變應(yīng)原引起的氣道疾病表現(xiàn)出更高的易感性，涉及不同機(jī)制，如IgE的增加和黏膜上嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)量的增加等[70-71]。一些研究表明腸道寄生蟲和菌群之間可能存在相互作用，因為它們都生活在同一個器官中，例如，人體寄生蟲感染與菌群多樣性的增加有關(guān)[72-73]。腸道菌群與疾病的關(guān)系是目前多個領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，但寄生蟲在其中是否存在重要的作用仍了解甚少，闡明寄生蟲感染與腸道菌群互相協(xié)作調(diào)控過敏性疾病的分子機(jī)制是未來研究方向之一。

6 小結(jié)

過敏性疾病患病率在全球的上升趨勢給社會增加了越來越多的醫(yī)療支出。歐洲農(nóng)場及我國農(nóng)村地區(qū)的保護(hù)性環(huán)境對于加深過敏性疾病的預(yù)防及調(diào)控機(jī)制提供了重要的對比研究模型。結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查研究以及小鼠模型，深入探討環(huán)境暴露因子對過敏性疾病的調(diào)控作用，有助于彌補(bǔ)對過敏性疾病發(fā)病分子機(jī)制的知識缺口，有助于開發(fā)新的防控措施。衛(wèi)生假說提出已有30年，且在不斷完善之中。結(jié)合目前本領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，本文為后續(xù)研究方向提供新的思路。