下口鲇爛尾病病原的分離與鑒定

徐赟霞　崔露文　趙良煒　鄧威　馮守明

摘 要：對患爛尾病下口鯰（Hypostomus plecostomus）的肝臟、脾臟、腎臟進行病原菌分離，分離到NY635菌株，用NY635菌株人工感染體重在20～30 g的健康魚，人工感染的下口鲇出現(xiàn)與自然發(fā)病魚相似的癥狀，并從人工感染的下口鲇病灶中分離出菌落形態(tài)相同的細菌。初步證明NY635是引起下口鲇爛尾病的病原。對NY635進行菌落形態(tài)觀察、生理生化鑒定和16S rDNA基因序列分析，確定菌株NY635為堿性假單胞菌（Pseudomonas alcaligenes），并對其進行了藥敏試驗。

關鍵詞：下口鲇（Hypostomus plecostomus）;爛尾病;堿性假單胞菌

下口鲇（Hypostomus plecostomus）俗名清道夫、吸盤魚、琵琶魚，屬鲇形目（Siluriformes）、甲鲇科（Loricariidae）、下口鲇亞科（Hypostominae）、下口鲇屬（Hypostomus）。原產(chǎn)于巴西、委內(nèi)瑞拉。魚體呈半圓筒型，側寬，尾鰭呈淺叉型，口下位，背鰭寬大，腹部扁平，左右腹鰭相連形成圓扇型吸盤。從腹面看，很像一個小琵琶，故又稱為琵琶魚[1]。魚體呈暗褐色，體上布滿黑色斑點。喜歡弱酸性軟水，適宜水溫20 ℃以上，常吸附在水族箱壁或者養(yǎng)殖池壁上，以舔食青苔或者池中的殘餌為食，是水族箱和養(yǎng)殖池里最好的清道夫，經(jīng)常與大型熱帶魚混養(yǎng)，隨著休閑漁業(yè)的發(fā)展，清道夫越來越受人青睞。

對于下口鲇細菌性疾病，國內(nèi)外沒有報道。對于同屬于鲇形目的大口鲇、黃顙魚等已有不少報道，病原菌主要有嗜水氣單胞菌、愛德華氏菌、蛭弧菌、普通變桿菌、溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌、哈維弧菌和阪崎腸桿菌等[2-8]，到目前為止還未報道過由堿性假單胞菌所引起的細菌性疾病。

2018年6月，天津市西青區(qū)某養(yǎng)殖場觀賞魚養(yǎng)殖車間的下口鲇發(fā)病，病魚尾部黏液脫落，進而尾部到腹部肌肉出血、潰爛，嚴重時尾部爛掉，死亡。本研究對病魚體表及病灶、肝臟、脾臟、腎臟進行病原菌分離，通過人工感染實驗驗證其致病性，并對病原菌的形態(tài)特征、生理生化特性、分類地位進行了研究。初步證明引起此次下口鲇疾病的病原為堿性假單胞菌（Pseudomonas alcaligenes），并對該細菌的藥物敏感性等進行了分析。這是中國首例堿性假單胞菌引起下口鲇疾病報道，為采取有效防治下口鲇爛尾病提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

病魚來自天津市西青區(qū)某養(yǎng)殖場，呈瀕死狀態(tài)，具有典型的出血、爛尾癥狀;人工感染用魚購于天津?qū)氎鎱^(qū)某觀賞魚養(yǎng)殖場，平均體重（25±3）g，平均體長（5±1）cm。

1.2 主要試劑

BHI瓊脂、TSB瓊脂、MH瓊脂、普通營養(yǎng)瓊脂、藥敏紙片均購自Oxoid公司;VITEK GN鑒定卡及相關生化鑒定試劑及相關配套試劑均購自法國梅里埃生化公司;PCR所用的試劑購于普洛麥格（Promega）生物技術有限公司。

1.3 病原菌分離純化與寄生蟲觀察

采用無菌操作，挑取典型癥狀病魚病灶、肝臟、脾臟、腎臟等組織，在BHI瓊脂平板上劃線分離，并置于（28±1） ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，從平板上選取優(yōu)勢菌落，進一步劃線分離，經(jīng)純化培養(yǎng)后用30%甘油凍存管于-80 ℃超低溫冰箱保存，供人工感染實驗和細菌學鑒定用。

取患病魚病灶處組織黏液、鰭條、鰓等樣品在顯微鏡下檢查寄生蟲。

1.4 人工感染實驗

將分離純化的優(yōu)勢菌株接種于TSB瓊脂上，（28±1） ℃培養(yǎng)24 h后，用3%滅菌生理鹽水沖洗菌苔，經(jīng)分光光度法和平板計數(shù)法測定菌懸液濃度為7.5×108 CFU/mL，然后用生理鹽水對該菌懸液進行梯度稀釋后分別制成7.5×107 CFU/mL、7.5×106 CFU/mL用于感染試驗的注射菌液。將購買的健康下口鲇暫養(yǎng)3 d后，開始進行人工感染試驗，將150尾健康的試驗魚分成5組，分別為3個實驗組、1個陰性對照組和1個空白對照組，每組30尾。實驗組從腹部注射0.1 mL的菌液，對照組注射0.1 mL的生理鹽水、空白組不做任何處理。注射后觀察魚的發(fā)病狀況和死亡情況，并且對瀕死病魚及時進行病原菌的分離和鑒定。

1.5 分離菌株的形態(tài)學觀察與生理生化指標鑒定

將病原菌接種在TSB瓊脂上，觀察細菌形態(tài)和大小，并對其進行革蘭氏染色。在無菌條件下挑取單個菌落制成菌懸液，采用VITEK GN鑒定卡對其進行生理生化特性測定。

1.6 16S rDNA基因序列測定和系統(tǒng)發(fā)育樹分析

挑取單個菌落于30 μL去離子水中，100 ℃金屬浴10 min后，12 000 r/min離心1 min后取上清作為PCR模板。16S rDNA序列擴增引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';1 492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'[9]反應體系50 μL：10×buffer 5 μL;Mg2+（25 mmol/L）3 μL;dNTP 4 μL;27F（20 um）1 μL，1 492R（20 μm）1 μL;ddH2O 33.6 μL;Taq（5 U/μL，TaKaRa）0.4 μL;DNA模板2 μL。擴增條件：94 ℃預變性 5 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 20 s，30 個循環(huán)，72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后送金唯智生物科技（北京）有限公司測序。測序結果通過NCBI中BLAST軟件進行在線比對，選取與其相似性最高的細菌16S rDNA基因序列，用MEGA6軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。選用鄰位相連法（Neighbor-joining）獲得系統(tǒng)發(fā)育樹，通過自舉分析（Bootstraping）進行系統(tǒng)進化樹的評估自舉數(shù)據(jù)集為1 000次。

1.7 藥物敏感性實驗

將耐藥菌株用生理鹽水稀釋到0.5麥氏濃度，用無菌的棉蘸子蘸取稀釋好的菌懸液，擠去多余的菌液，然后均勻涂布于MH平板上，靜置數(shù)分鐘待平板表面干燥后，用鑷子夾取藥敏紙片置于平板表面并壓緊，28 ℃倒置培養(yǎng)24 h后用直尺量取抑菌圈，結果判斷參照美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）標準[10]。藥敏紙片購自Oxoid公司，在有效期內(nèi)使用。抗菌藥物的藥敏紙片含量、藥敏實驗判定標準見表1。

2 結果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)學觀察和生理生化鑒定結果

通過鏡檢，未從發(fā)病的下口鲇病灶處組織黏液、鰭條、鰓等處檢驗出寄生蟲。從發(fā)病的下口鲇病灶出分離出一株優(yōu)勢菌，命名為NY635。對其進行分離純化培養(yǎng)，在TSB瓊脂平板上培養(yǎng)18～24 h后，菌落為黃色，圓形，表面濕潤，不透明，邊緣整齊（見圖1）。革蘭氏染色為陰性，菌體呈桿狀，（0.3～0.4）μm ×（1.0～2.1）μm，單個或成對排列（見圖2）。使用VITEK GN鑒定卡對其進行生理生化鑒定，結果為堿性假單胞菌，生理生化反應見表2。

2.2 致病性驗證

感染實驗共進行了7 d，如圖3所示，7.5×108 CFU/mL、7.5×107 CFU/mL、7.5×106 CFU/mL，在24 h內(nèi)均有魚出現(xiàn)死亡，7.5×108 CFU/mL在第六天全部死亡，7.5×107 CFU/mL、7.5×106 CFU/mL兩組在實驗結束后死亡累計率分別為63%和27%。陰性對照組和空白對照組均無死亡（見圖3）。人工感染后實驗魚游動緩慢，活力下降，魚體鱗片脫落，尾部出現(xiàn)紅腫，肌肉出血、潰爛，與自然感染下癥狀一致。而陰性對照組和空白對照組未出現(xiàn)任何異樣。參考李長紅[11]等（2009）的改良寇氏法，計算出菌株NY635對下口鲇7d的LD50為3.98×106 CFU/mL。

2.3 病原菌16S rDNA基因序列測定和系統(tǒng)發(fā)育樹分析

由引物 27F 和 1 492R 擴增菌株NY635的16S rDNA基因序列，獲得有效基因序列長度為1 351 bp，通過Blast 檢索發(fā)現(xiàn)其與假單胞菌屬序列同源性最高。從中找出相似度較高的10株菌株的16S rDNA基因序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4所示菌株NY635與Pseudomonas alcaligenes NBRC 14159T（BATI01000076）聚成一個分支，序列相似度在99%，親緣關系最為相近，再綜合生化鑒定結果，我們判定NY635為堿性假單胞菌。

2.4 藥物敏感性實驗結果

將MH平板放入28 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)24 h后，用直尺量取抑菌圈直徑，結果見表3。從結果上看NY635僅對頭孢噻肟、新霉素、利福平敏感，對其余的藥物均耐藥。

3 討論

目前有關養(yǎng)殖魚類爛尾病病原菌的研究已有很多，鲇魚苗爛尾病是由一種氣單胞菌引起[12]。南方大口鯰爛尾病，李成偉[3]等的研究結果是由愛德華氏菌感染引起的，舒妙安[13]等從患爛尾病的黃鱔中分離出堿性假單胞菌。本研究從患爛尾病的下口鲇中分離出來的NY635菌株為優(yōu)勢菌株，通過回感實驗驗證該菌對清道夫具有較強的致病性，人工感染的清道夫表現(xiàn)出尾部潰爛等與自然感染相同的癥狀。經(jīng)細菌形態(tài)特征、生理生化和16S rDNA基因序列比對等多種方法將該菌鑒定為堿性假單胞菌。目前堿性假單胞菌導致下口鲇患爛尾病并導致大量死亡的報道國內(nèi)外尚屬首次。

藥物敏感性試驗表明，NY635僅對頭孢噻肟、新霉素和利福平敏感，對其他藥物均嚴重耐藥?；前奉愃幬铩⒍辔鳝h(huán)素等最早應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖[14]，抗菌藥物使用的時間越長，魚類病原菌的敏感率越低。另外觀賞魚在防治病害時，不需要考慮藥物殘留的因素，對抗菌藥物使用劑量和使用頻率問題也沒有限制，也是造成NY635對抗菌藥物敏感性低的原因。David[15]等對觀賞魚源細菌的藥物敏感性研究也證實了這一點，徐立蒲[16]等研究也發(fā)現(xiàn)，不同種類魚源病原菌中，觀賞魚源病原菌對抗菌藥物敏感性最低。雖然在觀賞魚養(yǎng)殖過程中濫用藥物，不會危及食品安全也無需考慮藥物殘留的因素，但是抗生素濫用也會破壞水域生態(tài)環(huán)境，未進行正確診斷病原和篩選敏感藥物，而隨意選擇抗菌藥物用于防治細菌性疾病，治療失敗的風險增大，而且延誤治療的最佳時機，應該引起人們的思考。本研究中，下口鲇爛尾病主要是由于清道夫受到損傷后感染堿性假單胞菌而引起的，因此預防此病必須在運輸、放養(yǎng)、捕撈的過程中盡量避免機械損傷，并且保持池中水質(zhì)良好。治療此病的時候不要盲目濫用藥，以免造成病原菌對藥物選擇的壓力變大。

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Isolation and identification of pathogen which caused tail rot disease of Hypostomus plecostomus

XU Yun-Xia，CUI Lu-Wen，ZHAO Liang-Wei，DENG Wei， FENG Shou-Ming

（TianJinCenter for Control and Prevention of Aquatic Animal Infectious Disease，Tianjin 300221，China）

Abstract：The characteristics of pathogenic bacteria causing tail rot were isolated from the liver，spleen and the kidney in Hypostomus plecostomus，obtained NY635 strain，and used NY635 strain to infect the Hypostomus plecostomus which weighted at 20～30 g/ind.The infected Hypostomus plecostomus caused symptoms similar to those of naturally occurring，and same bacteria were isolated from infected Hypostomus plecostomus.It can be confirmed that NY635 is the pathogen bacteria of Hypostomus plecostomus rotten tail disease.According to the morphological? features ，physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA gene sequencing，NY635 stain was identified as Pseudomonas alcaligenes，and drug sensitivity test was carried out.

Key words：Hypostomus plecostomusis; tail rot disease; Pseudomonas alcaligenes

（收稿日期：2019-10-23）

作者簡介：馮守明（1965-），男，博士，研究員，研究方向：免疫學。E-mail：smfeng65@163.com。