魚(yú)用功能性卵黃粉對(duì)鰻鱺的免疫保護(hù)和生長(zhǎng)性能的影響

■ 李英英 宋鐵英 江興龍 葛均青 陳 曦2，*

（1.鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建廈門(mén)361021；2.福建省特種水產(chǎn)配合飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350300；3.福建省農(nóng)科院生物技術(shù)研究所，福建福州350003）

我國(guó)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)過(guò)30多年的發(fā)展，目前產(chǎn)量已經(jīng)位居全球首位[1-2]，但隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖集約化和規(guī)?；陌l(fā)展，水產(chǎn)動(dòng)物病害頻發(fā)。嗜水氣單胞菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物暴發(fā)性傳染病的主要病原菌之一[3]，在生產(chǎn)上有極大的危害性。目前長(zhǎng)期大量使用抗生素的防治措施容易使病原菌產(chǎn)生耐藥性[4-5]，因此，研究抗生素或化學(xué)藥物替代品已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[6]。

卵黃抗體（IgY）具有類似哺乳動(dòng)物IgG的免疫活性，并且理化性質(zhì)穩(wěn)定[7]，特異性強(qiáng)，不產(chǎn)生耐藥性[8]，且對(duì)腸道正常的菌群無(wú)副作用[9]，近年來(lái)，卵黃抗體作為抗生素替代品或飼料添加劑已廣泛的運(yùn)用于畜禽疾病的防治[10-12]。前期研究中，本研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)成功制備了多價(jià)嗜水氣單胞菌腸外膜蛋白（MOMP）-ISCOMs保護(hù)性抗原[13]，并制備了相應(yīng)的魚(yú)用功能性卵黃粉[14]，本文擬通過(guò)對(duì)該魚(yú)用功能性卵黃粉所含抗嗜水氣單胞菌MOMP卵黃抗體的效價(jià)和特異性分析，結(jié)合對(duì)鰻鱺的免疫攻毒保護(hù)和投喂生長(zhǎng)性能分析，為該魚(yú)用功能性卵黃粉防控嗜水氣單胞菌所引起的疾病提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 魚(yú)用功能性卵黃粉所含卵黃抗體效價(jià)及特異性分析

1.1.1 ELISA法檢測(cè)卵黃抗體免疫效價(jià)

以前期研究[15]中所獲得的3株代表菌（ZN1、TPS30和WC）的嗜水氣單胞菌外膜蛋白（MOMP）作為包被物（3株菌MOMP的蛋白比例為1∶1∶1），包被量為10 μg/ml，第1抗體為1∶20開(kāi)始倍比稀釋的卵黃抗體，第2抗體為1∶20 000稀釋的HRP酶標(biāo)記羊抗雞IgG（Sigma）。OPD顯色，終止后讀取OD492值，以S/N≥2.1結(jié)果為陽(yáng)性。

1.1.2 卵黃抗體Western blot分析

將上述3株代表菌（ZN1、TPS30和WC）的嗜水氣單胞菌外膜蛋白（MOMP）進(jìn)行SDS-PAGE電泳，半干法轉(zhuǎn)印至NC膜，用5%BSA封閉后依次加入第1抗體和第2抗體進(jìn)行孵育。其中第1抗體為1∶100稀釋的卵黃抗體，第2抗體為1∶20 000稀釋的HRP酶標(biāo)記羊抗雞IgG（Sigma）。DAB法顯色。

1.2 魚(yú)用功能性卵黃粉對(duì)鰻鱺的免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)

試驗(yàn)鰻鱺購(gòu)自福建省長(zhǎng)樂(lè)某鰻鱺場(chǎng)，規(guī)格為（80±5）g/尾，18尾隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組9尾。鰻鱺在試驗(yàn)室魚(yú)箱中養(yǎng)殖，溫度25℃左右，每日換水1/3。對(duì)照組投喂鰻鱺飼料，試驗(yàn)組在鰻鱺飼料中添加0.3%魚(yú)用功能性卵黃粉，每天上午和下午各投喂一次，連喂13 d后，2組鰻鱺每只由腹腔注射1×108CFU的ZN1，每天觀察1次，連續(xù)觀察15 d，計(jì)算鰻鱺存活率。

1.3 魚(yú)用功能性卵黃粉對(duì)鰻鱺的生長(zhǎng)性能測(cè)定

魚(yú)用功能性卵黃粉對(duì)鰻鱺的生長(zhǎng)性能的應(yīng)用分別在福建省長(zhǎng)樂(lè)市、尤溪縣和福清市的3家商品化鰻鱺養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行,統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)組和對(duì)照組鰻鱺總投料量、總增重量，每口池隨機(jī)抽取適當(dāng)尾數(shù)鰻鱺測(cè)定規(guī)格，計(jì)算尾數(shù)和成活率，比較試驗(yàn)組和對(duì)照組增重率、飼料轉(zhuǎn)化率和死亡率。

1.3.1 生長(zhǎng)性能測(cè)定試驗(yàn)1（長(zhǎng)樂(lè)）

長(zhǎng)樂(lè)的某鰻鱺養(yǎng)殖場(chǎng)的試驗(yàn)。隨機(jī)選取30口同等條件池，15口池設(shè)為試驗(yàn)組，15口池設(shè)為對(duì)照組，試驗(yàn)組每池平均14 758尾，每尾平均123.1 g，對(duì)照組每池平均11 156尾，每尾平均137.9 g。魚(yú)用功能性卵黃粉按0.3%的量拌料口服，對(duì)照組投喂未添加魚(yú)用功能性卵黃粉的同質(zhì)飼料，養(yǎng)殖周期109 d。

1.3.2 生長(zhǎng)性能測(cè)定試驗(yàn)2（尤溪）

在尤溪縣鰻鱺養(yǎng)殖場(chǎng)，隨機(jī)選取4口同等條件池，2口池設(shè)為試驗(yàn)組，2口池設(shè)為對(duì)照組。試驗(yàn)組2口池塘分別為21 996尾和21 600尾，均重分別為153.8 g/尾和138.9 g/尾，對(duì)照組2口池塘分別為24 528尾和16 720尾，均重分別為142.9 g/尾和131.6 g/尾。按照飼料重量0.3%的比例添加魚(yú)用功能性卵黃粉，混合均勻后投喂。對(duì)照組投喂未添加魚(yú)用功能性卵黃粉的同質(zhì)飼料，養(yǎng)殖周期56 d。

1.3.3 生長(zhǎng)性能測(cè)定試驗(yàn)3（福清）

在福清市鰻鱺養(yǎng)殖場(chǎng)，隨機(jī)選取4口同等條件池，2口池設(shè)為試驗(yàn)組，2口池設(shè)為對(duì)照組，養(yǎng)殖品種為日本鰻。試驗(yàn)組2口池塘分別為21 461尾和27 899尾，均重分別為181.2 g/尾和178.6 g/尾，對(duì)照組2口池塘分別為18 948尾和26 396尾，均重分別為181.29 g/尾和172.4 g/尾。按照飼料重量0.3%的比例添加魚(yú)用功能性卵黃粉，混合均勻后投喂。對(duì)照組投喂未添加魚(yú)用功能性卵黃粉的同質(zhì)飼料，養(yǎng)殖周期52 d。

2 結(jié)果

2.1 魚(yú)用功能性卵黃粉所含卵黃抗體特異性及效價(jià)分析

ELISA效價(jià)檢測(cè)顯示，魚(yú)用功能性卵黃粉所含MOMP卵黃抗體對(duì)嗜水氣單胞菌3株代表菌的外膜蛋白（MOMP）抗原的抗體效價(jià)均達(dá)到1∶10 240（表1）。將魚(yú)用功能性卵黃粉所含MOMP卵黃抗體與嗜水氣單胞菌3株代表菌的MOMP進(jìn)行Western blot染色結(jié)果顯示，卵黃抗體能與嗜水氣單胞菌3株代表菌的MOMP抗原特異結(jié)合（圖1），說(shuō)明制備的卵黃抗體具有對(duì)嗜水氣單胞菌外膜蛋白抗原的良好特異性。

表1 魚(yú)用功能性卵黃粉對(duì)嗜水氣單胞菌MOMP抗原的抗體效價(jià)

圖1 嗜水氣單胞菌MOMP卵黃抗體對(duì)3種嗜水氣單胞菌MOMP的Western-blot結(jié)果

2.2 魚(yú)用功能性卵黃粉對(duì)鰻鱺的免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)（見(jiàn)表2）

表2 魚(yú)用功能性卵黃粉投喂鰻鱺后抵抗嗜水氣單胞菌攻擊的存活率比較

由表2結(jié)果顯示，飼喂魚(yú)用功能性卵黃粉13 d后，試驗(yàn)組的鰻鱺攻毒后15 d成活率較對(duì)照組提高75.2%（表2），說(shuō)明鰻鱺飼喂魚(yú)用功能性卵黃粉后對(duì)嗜水氣單胞菌具有攻毒保護(hù)作用。

2.3 鰻鱺飼喂魚(yú)用功能性卵黃粉后生長(zhǎng)性能測(cè)定

2.3.1 鰻鱺生長(zhǎng)性能測(cè)定1（長(zhǎng)樂(lè)）

長(zhǎng)樂(lè)鰻鱺養(yǎng)殖場(chǎng)的結(jié)果顯示，添加魚(yú)用功能性卵黃粉的試驗(yàn)組鰻鱺的增重較對(duì)照組提高42.9%，飼料轉(zhuǎn)化效率比對(duì)照組提高10.7%（圖2A），兩者死亡率差別均較低，無(wú)明顯差別（圖2B）。

2.3.2 鰻鱺生長(zhǎng)性能測(cè)定2（尤溪）

在尤溪縣鰻鱺養(yǎng)殖場(chǎng)投放按照飼料重量0.3%的比例添加魚(yú)用功能性卵黃粉的飼料的試驗(yàn)結(jié)果表明，加功能性卵黃粉前后，試驗(yàn)組平均增重比對(duì)照提高了13.6%，平均飼料轉(zhuǎn)化率提高了3.11%（圖3A），試驗(yàn)組與對(duì)照組的死亡率均較低，差別不顯著（圖3B）。

圖2 長(zhǎng)樂(lè)某鰻鱺養(yǎng)殖場(chǎng)投喂魚(yú)用功能性卵黃粉生長(zhǎng)性能比較

圖3 尤溪某鰻鱺養(yǎng)殖場(chǎng)投喂魚(yú)用功能性卵黃粉養(yǎng)殖效果

2.3.3 鰻鱺生長(zhǎng)性能測(cè)定3（福清）

在福清鰻鱺養(yǎng)殖場(chǎng)，試驗(yàn)組的平均增重及飼料轉(zhuǎn)化率與對(duì)照組相比，分別提高了8.88%及2.55%（圖4A）。但是加魚(yú)用功能性卵黃粉前后試驗(yàn)組與對(duì)照組的死亡率差別明顯，試驗(yàn)組較對(duì)照組平均死亡率降低了38.8%。

圖4 福清某鰻鱺養(yǎng)殖場(chǎng)投喂魚(yú)用功能性卵黃粉養(yǎng)殖效果

3 討論

卵黃抗體作為飼料添加劑，在水產(chǎn)動(dòng)物主要應(yīng)用于鱉和蝦類上。李肖梁等[16]使用滅活的嗜水氣單胞菌卵黃抗體，添加到中華鱉飼料中發(fā)現(xiàn)，卵黃抗體組與對(duì)照組在日增重上差異顯著。雷勇[17]制備的抗白斑綜合征病毒（WSSV）卵黃抗體，能延緩螯蝦的死亡時(shí)間，使螯蝦死亡率從100%降至30%。而抗WSSV卵黃抗體對(duì)于提高對(duì)蝦免疫因子的活性，對(duì)于提高抗WSSV感染能力也有一定作用[18]。朱香萍等[19]制備的鰻弧菌卵黃抗體，對(duì)蝦鰻弧菌感染具有可靠的保護(hù)作用。

在本試驗(yàn)中，通過(guò)ELISA和Western blot檢測(cè)，顯示制備的魚(yú)用功能性卵黃粉，抗體效價(jià)較高，特異性強(qiáng)。在攻毒試驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)功能性卵黃粉投喂的鰻鱺攻毒存活率為77.8%，未投喂功能性卵黃粉的鰻鱺攻毒存活率僅44.4%，充分說(shuō)明該功能性卵黃粉能夠增強(qiáng)鰻鱺抵抗嗜水氣單胞菌的侵染能力。

生長(zhǎng)性能測(cè)定結(jié)果顯示，在鰻鱺飼料中添加0.3%的魚(yú)用功能性卵黃粉后，三組鰻鱺的增重和飼料轉(zhuǎn)化率較對(duì)照組均有上升（圖2～圖4）。其中在增重方面，長(zhǎng)樂(lè)鰻鱺養(yǎng)殖場(chǎng)的結(jié)果最為明顯（42.9%），充分表明了魚(yú)用功能性卵黃粉對(duì)于鰻鱺生長(zhǎng)的促進(jìn)作用和其應(yīng)用潛力。增重和飼料轉(zhuǎn)化率均提高的原因，一是魚(yú)用功能性卵黃粉所含的卵黃抗體本身作為優(yōu)質(zhì)蛋白源，被鰻鱺吸收后可促進(jìn)飼料轉(zhuǎn)化率的提高[20]；二是卵黃抗體在腸道中能夠阻斷嗜水氣單胞菌對(duì)宿主腸黏膜的黏附作用，中和或抑制毒力因子對(duì)宿主細(xì)胞的致病作用[21]，從而減少了嗜水氣單胞菌等病菌對(duì)于其腸道侵?jǐn)_的幾率，提高了腸道對(duì)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。而在死亡率上，福清鰻鱺養(yǎng)殖場(chǎng)在投喂魚(yú)用卵黃粉前后，試驗(yàn)組和對(duì)照組兩者間的差別（圖4），也充分說(shuō)明該卵黃粉中的抗體能有效增強(qiáng)魚(yú)體抗嗜水氣單胞菌等病菌的能力，從而提高魚(yú)體健康水平和養(yǎng)殖過(guò)程中的存活率。

4 結(jié)論

通過(guò)本文的研究，表明采用0.3%的功能性卵黃粉添加鰻鱺飼料，可有效降低嗜水氣單胞菌對(duì)于鰻鱺的侵染，降低鰻鱺的死亡率，并能提高生長(zhǎng)性能。因此，其可用于嗜水氣單胞菌感染引起的鰻鱺疾病的預(yù)防和控制。雖然卵黃抗體在產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化等方面需要進(jìn)一步加強(qiáng)[22]，但其作為新型飼料添加劑，將會(huì)成為抗生素和化學(xué)合成藥物的可能替代品，得到更大的研究和開(kāi)發(fā)應(yīng)用。