綠山楂種子內(nèi)源抑制物成分的初步鑒定

， ，，

(1.南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 南京 210037；2.山西省林業(yè)種苗管理總站, 太原 030012)

綠山楂(CrataegusviridisL.)是薔薇科山楂屬落葉小喬木，原產(chǎn)于美國德克薩斯州的東部[1]。大多數(shù)山楂樹枝上有許多枝刺，但綠山楂樹枝上很少或幾乎沒有刺。夏季，綠山楂樹葉呈黃綠色到深綠色，秋天變成紫紅色、青銅色或金色。綠山楂通常于早春開花，有明顯的白色花朵，花5 瓣。果實(shí)桔色至紅色，可保留到第2年春季，具有較高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2]。綠山楂生長速度中等，喜好潮濕、肥沃且排水良好的土壤，適應(yīng)能力較強(qiáng)，易栽培，耐修剪，可在我國的東北南部、華北、江蘇一帶栽植，是良好的庭院栽培樹種。

綠山楂一般采取種子繁殖，但是其種子具有明顯的休眠特性，一般需要經(jīng)過兩冬一夏的層積才能解除休眠，這給綠山楂的播種育苗生產(chǎn)帶來了很多不便。國內(nèi)外關(guān)于種子休眠機(jī)理的研究較多。Albertus Magus早在13世紀(jì)初便提出種子推遲發(fā)芽與抑制物質(zhì)有關(guān)[3]。自1975年Khan[4]提出“三因子學(xué)說”以來，各種各樣的植物內(nèi)源抑制物不斷被發(fā)現(xiàn)。不同植物中含有的內(nèi)源抑制物不盡相同，張艷杰等[5]對南方紅豆杉[Taxuschinensisvar.mairei(Lemee et I’ev1.)] 種子中存在的抑制物進(jìn)行了研究，證實(shí)了南方紅豆杉種子的胚乳、中種皮和內(nèi)種皮中均含有抑制種子萌發(fā)和幼苗生長的物質(zhì)。王小平、王九齡研究了白皮松(PinusbungeanaZuce.)種子中的內(nèi)源抑制物，發(fā)現(xiàn)種子各部位抑制作用由強(qiáng)到弱的順序?yàn)椋和夥N皮、內(nèi)種皮、胚乳；他們還發(fā)現(xiàn)白皮松種子中ABA類物質(zhì)不是引起種子休眠的唯一抑制劑，休眠是由多種抑制物共同作用的，因此萌發(fā)抑制劑具有多樣性的特點(diǎn)[6]。趙敏等的研究表明，刺五加果實(shí)及其外果皮、中果皮、種子中均含有一定活性的內(nèi)源抑制物質(zhì)，且外果皮、中果皮、種子中所含的內(nèi)源抑制物質(zhì)對白菜籽萌發(fā)的抑制活性高于對白菜幼根生長的抑制活性[7]。關(guān)于山楂屬植物種子休眠機(jī)理的研究有很多，楊曉玲等對山楂屬不同樹種種子中抑制物的活性進(jìn)行了比較研究，結(jié)果表明：種子各部位如種殼、種皮和種仁中均含有抑制物質(zhì)，且不同種類的山楂種子解除休眠的難易程度不同[8]；他們還發(fā)現(xiàn)，山楂種子層積過程中抑制物質(zhì)的活性也逐漸降低[9]。朱梅玲等認(rèn)為，酚類物質(zhì)是山楂種子發(fā)芽的抑制物，層積過程中種子內(nèi)所含酚類物質(zhì)含量也逐漸降低[10]。苗衛(wèi)東等在研究不同種類野生山楂種子休眠解除方法時(shí)發(fā)現(xiàn)，濃硫酸可以使山楂種殼均勻變薄，重量減輕，種孔堵塞物消除，種皮透氣、透水性增加，從而促進(jìn)山楂種子的萌發(fā)[11]。還有研究認(rèn)為，GA有促進(jìn)山楂種子萌發(fā)的作用，而ABA對種子萌發(fā)有抑制作用[12-13]。張培玉等研究了在不同采收期、室溫干藏和層積過程中山楂種子GA3、IAA、ABA含量變化規(guī)律及其與休眠的關(guān)系，認(rèn)為GA3、IAA對打破休眠、促進(jìn)萌發(fā)有一定作用，而ABA則是抑制種子萌發(fā)的重要因素[14]。李秉真等研究了山楂種子的休眠與后熟期間內(nèi)源激素的變化，研究顯示，層積時(shí)間越長，山植種子中ABA含量越低，IAA/ABA值持續(xù)增加，因此ABA對山楂種子萌發(fā)有一定的抑制作用，低含量的ABA不會影響種子的萌發(fā)[15]。

盡管不同學(xué)者對山楂屬植物休眠原因開展了一系列的研究，但對造成綠山楂休眠抑制物的種類還不清楚。本研究擬通過系統(tǒng)溶劑分離法對綠山楂種子的內(nèi)源抑制物質(zhì)進(jìn)行萃取，并對各有機(jī)相萃取液進(jìn)行生物測定，同時(shí)結(jié)合GC-MS技術(shù)鑒定各有機(jī)相分離的內(nèi)源抑制物的成分，以期為綠山楂種子內(nèi)源抑制物及其休眠機(jī)理研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

綠山楂種子從美國購買后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩９┰嚢撞俗?矮腳黃)購于南京金盛達(dá)種子公司，純度≥95.0%，發(fā)芽率≥85%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 千粒重測定

采用百粒法測定，隨機(jī)數(shù)取綠山楂種子各100 粒×8 重復(fù)，用千分之一電子天平分別稱重并做好記錄，根據(jù)ISTA 規(guī)則(2013)[16]計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差和千粒重。

1.2.2 綠山楂種子抑制物的初步分離

稱取綠山楂種子100 g，磨碎成粉后，置于1 000 mL的錐形瓶中，分幾次加入1 500 mL 80%的甲醇溶液，參考張艷杰[17]的方法，得到甲醇浸提液，加入蒸餾水定容至300 mL。用系統(tǒng)溶劑法[18]對上述甲醇浸提液進(jìn)行初步分離(見圖1)。將粗提液先后分離為5個(gè)組分：石油醚相、乙醚相、乙酸乙酯相、甲醇相及水相。然后將各有機(jī)相溶液分別置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-3000上進(jìn)行濃縮蒸發(fā)，最后將各有機(jī)相定容為50 mL，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 綠山楂種子中抑制物質(zhì)提取流程圖

圖2 乙醚相提取物的離子流程圖

1.2.3 不同相的生物活性測定

將上述各相提取的溶液進(jìn)行生物活性測定。隨機(jī)數(shù)取白菜籽50粒，分別在各相的2 mL溶劑中浸泡3 h。隨后在直徑9 cm的培養(yǎng)皿中鋪上濾紙，分別加入各內(nèi)源抑制物浸提液5 mL。待其自然晾干后，放入對應(yīng)相處理后晾干的白菜籽，以清水處理作為對照。將試驗(yàn)材料置于25 ℃光照培養(yǎng)箱中發(fā)芽，每個(gè)處理重復(fù)3次。計(jì)算發(fā)芽率[19]和發(fā)芽指數(shù)[20]。

1.2.4 綠山楂種子各有機(jī)相化學(xué)成分的鑒定

取各有機(jī)相相同體積的浸提液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-3000內(nèi)減壓濃縮蒸干，然后用相應(yīng)的有機(jī)溶劑溶解、定容至2mL，即得到各有機(jī)相提取物的濃縮樣品。各濃縮樣品在色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用儀進(jìn)行成分鑒定，儀器型號為：美國安提綸6890 N/5973 N(中國林業(yè)科學(xué)院林產(chǎn)化學(xué)研究所分析測定中心)。氣相色譜條件依據(jù)韓寶瑞等[21]的方法，最后由計(jì)算機(jī)控制的庫存信號檢查各個(gè)成分的質(zhì)譜圖并與標(biāo)準(zhǔn)譜圖核對。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 軟件以及SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子千粒重的測定結(jié)果與分析

千粒重是反映種子大小與飽滿程度的重要指標(biāo)[22]。本次采用百粒法測定綠山楂種子的千粒重為21.56 g，標(biāo)準(zhǔn)差為0.002 8，變異系數(shù)為1.30%，因此綠山楂種子個(gè)體之間重量變化不大。

2.2 綠山楂種子中各分離相的生物活性測定

白菜種子發(fā)芽快速、整齊，故常被用來驗(yàn)證各分離相提取物質(zhì)的生物活性。本次各分離相對白菜籽發(fā)芽的影響見表1。

初期的預(yù)試驗(yàn)表明，石油醚、乙醚、乙酸乙酯和甲醇4種有機(jī)溶劑自身對白菜籽發(fā)芽均沒有顯著影響，因此本研究中浸提液處理后白菜籽發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)的變化均是由浸提液中的內(nèi)源抑制物引起的。從表1可以看出：與對照組相比，綠山楂種子的乙醚相、乙酸乙酯相、甲醇相均對白菜籽發(fā)芽有顯著抑制作用，并且乙醚相的抑制作用最強(qiáng)，發(fā)芽率從對照的93.3%下降到0.7%，降低了92.6%；其次為甲醇相，發(fā)芽率下降到4.0%，較對照降低了89.3%；再次為乙酸乙酯相，發(fā)芽率下降到58.0%，較對照降低了35.3%。白菜籽在石油醚相和水相的發(fā)芽率雖有小幅下降，但與對照相比下降不顯著。

表1 綠山楂種子中各分離相對白菜籽發(fā)芽的影響

處理發(fā)芽率(%)發(fā)芽指數(shù)發(fā)芽指數(shù)較對照組下降的百分?jǐn)?shù)(%)對照93.3±1.3a18.6±0.3a0石油醚相91.3±1.8a18.6±0.5a0乙醚相0.7±0.7c0.1±0.1c99.5乙酸乙酯相58.0±7.6b10.5±1.5b43.5甲醇相4.0±1.2c0.6±1.2c96.8水相92.7±1.3a17.1±1.0a8.1

綠山楂種子各分離相溶液處理白菜種子后，其發(fā)芽指數(shù)與對照組相比也有一定的降低。其中，石油醚相、水相的發(fā)芽指數(shù)較對照無顯著差異；乙醚相、甲醇相的發(fā)芽指數(shù)較對照組分別下降了99.5%、96.8%。白菜籽的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)結(jié)果均表明：綠山楂種子的甲醇、乙醚、乙酸乙酯分離相中可能存在一些發(fā)芽抑制物質(zhì)。

2.3 綠山楂種子主要內(nèi)源抑制物組分成分的鑒定

圖2為綠山楂種子乙醚相提取物經(jīng)GC-MS分析的離子流程圖，共分離出63個(gè)峰。

通過質(zhì)譜系統(tǒng)檢索并與標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行核對，離子流程圖中相似度大于85%的化合物的結(jié)果見表2。本次乙醚相中鑒定出的主要的有機(jī)化合物含量占總峰面積的74.1%，相對含量較多的為：未知物質(zhì)1(18.1%)，beta-谷甾醇(13.0%)、2，6-二叔丁基對甲苯酚(12.0%)、1，2-苯并異噻唑-3-酮(5.9%)、亞油酸(5.2%)等。

表2 綠山楂種子主要內(nèi)源抑制物組分成分分析

有機(jī)溶劑相序號 序號 時(shí)間 中文名 英文名 分子式 分子量 相對含量 (%) 乙醚相17.6582,2,4,6,6-五甲基庚烷2,2,4,6,6-pentamethyl-HeptaneC12H261700.7219.686香蘭素VanillinC8H8O31523.1322.6112,6-二叔丁基對甲苯酚2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenolC15H24O22012.0426.225丁香醛3,5-Dimethoxy-4-hydroxyben zaldehydeC9H10O41822.0528.033未知14.9631.975棕櫚酸甲酯Methyl hexadecanoateC17H34O22701.9735.322亞油酸9,12-Octadecadienoicacid,methyl esterC19H34O22945.2835.437順式-十八碳烯酸methyl 11-octadecenoateC19H36O22963.0946.737芥酸酰胺ErucylamideC22H43NO3374.31054.8171,2-苯并異噻唑-3-酮1,2-Benzisothiazolin-3-oneC7H5NOS1515.91157.489beta-谷甾醇beta-SitosterolC29H50O41413.01259.937未知1Hopa-22(29)-ene3β-ol18.1合計(jì)74.1甲醇相110.662愈創(chuàng)木酚GuaiacolC7H8O21242.0214.9124-羥基苯硫酚4-MercaptophenolC6H6OS1262.7317.274對乙烯基愈瘡木酚2-Methoxy-4-vinylphenolC9H10O21501.3418.325紫丁香醇2,6-DimethoxyphenolC8H10O31542.5519.623香蘭素(E)-2-甲氧基-4-(1-丙烯基苯酚)VanillinC8H8O31521.4620.969Phenol,2-methoxy-4-(1Z)-1-propen-1-yl-C10H12O21642.3721.0424-羥基-3-甲氧基芐醇4-Hydroxy-3-methoxybenzyl alcoholC8H10O31541.0824.0463-羥基-4-甲氧基苯甲酸3-Hydroxy-4-methoxybenzoic acidC8H8O41681.3925.0653,4,5-三甲氧基苯酚3,4,5-TrimethoxyphenolC9H12O41841.61026.221丁香醛3,5-Dimethoxy-4-hydroxybenzaldehydeC9H10O41822.71127.1534-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚Phenol,2,6-dimethoxy-4-(2-propen-1-yl)-C11H14O31941.81227.743未知12.11327.9034-羥基-3-甲氧基肉桂醛2-Propenal,3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-C10H10O31.71428.0655-乙酰氨甲基-4-氨基-2-甲基嘧啶4-((1E)-3-Hydroxy-1-propenyl)-2-methoxyphenolC8H12N4O18018.01532.897二苯基乙酸甲酯Benzeneacetic acid,a-phenyl-, methyl esterC15H14O22262.51633.399未知24.11744.911未知33.2合計(jì)52.2乙酸乙酯相120.991(E)-2-甲氧基-4-(1-丙烯基苯酚)Phenol,2-methoxy-4-(1Z)-1-propen-1-yl-C10H12O21642.7222.424未知1Tridecane, 7-methyl-C14H301982.4326.222丁香醛3,5-Dimethoxy-4-hydroxybenzaldehydeC9H10O41821.9427.889松柏醛2-Propenal,3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-C10H10O31785.2527.996未知237.4630.038未知34.5744.922醌茜素1,2,5,8-tetrahydroxy anthraquinoneC14H8O62723.5846.734芥酸酰胺ErucylamideC22H43NO3371.7合計(jì)59.3石油醚相131.977棕櫚酸甲酯Methyl hexadecanoateC17H34O22702.7235.330亞油酸9,12-Octadecadienoicacid, methyl esterC19H34O22948.3335.444順式-十八碳烯酸methyl11-octadecenoate Phthalic acid,C19H36O22963.9443.244鄰苯二甲酸單酯mono-(2-ethylhexyl) esterC16H22O42782.7546.745油酸酰胺OleamideC18H35NO2813.6657.537γ-谷甾醇Stigmast-5-en-3-ol,(3b,24S)-C29H50O41422.5759.997未知124.9861.966未知21.2合計(jì)69.8

甲醇相中的離子流程圖共得到129峰，按上述原則鑒定出的主要有機(jī)化合物含量占總峰面積的52.2%(表2)，相對含量較大的幾種物質(zhì)為：5-乙酰氨甲基-4-氨基-2-甲基嘧啶(18.0%)、未知物質(zhì)2(4.1%)、未知物質(zhì)3(3.2%)、丁香醛(2.7%)等(表2)。乙酸乙酯相中的離子流程圖共得到75峰，按上述原則鑒定出的主要有機(jī)化合物含量占總峰面積的59.3%，相對含量較大的幾種物質(zhì)為：未知物質(zhì)2(37.4%)、松柏醛(5.2%)、未知物質(zhì)3(4.5%)、醌茜素(3.5%)等。石油醚相中離子流程圖共得到91峰，通過質(zhì)譜系統(tǒng)檢索并與標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行核對，相似度大于85%的主要有機(jī)化合物含量占總峰面積的69.8%。其中相對含量占優(yōu)勢的為未知物質(zhì)1(24.9%)、γ-谷甾醇(22.5%)、亞油酸(8.3%)、順式-十八碳烯酸(4.0%)、油酸酰胺(3.6%)等。

3 結(jié)論與討論

3.1 抑制物的生物活性測定

張艷杰等采用系統(tǒng)溶劑法分離了南方紅豆杉種皮和胚乳中的抑制物質(zhì)，并進(jìn)行了抑制活性測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇相的抑制性幾乎達(dá)到100%，從而猜測甲醇相中含有較多的抑制物[17]；韓寶瑞等在證明西洋參果實(shí)中存在發(fā)芽抑制物的同時(shí)，發(fā)現(xiàn)乙醚相和甲醇相的抑制效果大于其他各組分[23]；孫曉剛等在研究鳳丹(Paeoniaosstii)種子胚乳中內(nèi)源抑制物質(zhì)活性及其成分組成時(shí)發(fā)現(xiàn)，鳳丹胚乳各有機(jī)溶劑萃取液對白菜種子發(fā)芽率和幼苗高生長、根長生長均有不同程度的抑制作用，但抑制物質(zhì)活性存在一定差異，乙醚相的抑制效果最強(qiáng)，其次是甲醇相[24]。在本研究中，綠山楂種子各有機(jī)相的生物測定結(jié)果(表1)表明，各分離組分對白菜種子的發(fā)芽均有一定的抑制作用，抑制作用最強(qiáng)的是乙醚相，其次是甲醇相。這與前人研究結(jié)果基本一致。

3.2 內(nèi)源抑制物對種子萌發(fā)的影響

已有研究發(fā)現(xiàn)，造成種子休眠的內(nèi)源抑制物種類較多，主要包括ABA 、醛類、有機(jī)酸、氫氰酸、芥子油、香豆素類、氨以及脂肪酸等。郭廷翹等研究發(fā)現(xiàn)，水曲柳(FraxinusmandshuricaRupr)種子中的ABA以及油酸、亞油酸等長鏈脂肪酸都可以抑制該種子的萌發(fā)[25]。棕櫚酸甲酯也已被證實(shí)對玉米、黃豆、黃瓜、水稻4種作物胚根、胚芽的生長有顯著抑制作用[26]。酚類物質(zhì)常存在于某些植物的器官中，多數(shù)酚類物質(zhì)對種子萌發(fā)也會起抑制作用。楊曉玲等研究表明，層積后尚未解除休眠的山楂種子，種仁和種皮中酚類物質(zhì)雖有下降，但降低不明顯，而解除休眠后的種子中酚類物質(zhì)下降明顯，因此該種子休眠的解除可能與酚類物質(zhì)含量的下降有關(guān)[27]。還有一些研究發(fā)現(xiàn)：羥基苯甲酸、香草酸、香豆素等會明顯抑制春小麥胚根和胚芽生長[28]，這也可能是抑制種子萌發(fā)的物質(zhì)。

本研究中綠山楂種子的乙醚相、甲醇相、乙酸乙酯相中也被檢測出上述被證實(shí)過的某些內(nèi)源抑制物，如酚類物質(zhì)、亞油酸、棕櫚酸甲酯、蒽醌類、醛類和酰胺類等，且相對含量較多。因此推測，這可能是造成綠山楂種子休眠的原因之一,也有可能是幾種物質(zhì)相互作用從而導(dǎo)致種子休眠。本次石油醚相中檢測到的主要化合物為有機(jī)酸類、酰胺類和醇類等物質(zhì)，以往的研究表明，這些物質(zhì)中有的也是造成種子休眠的原因，但本次石油醚相的生物活性測定結(jié)果(表1)表明，該相的抑制活性較弱，這可能是由于這些物質(zhì)在該相中的含量較低造成的。由于GC-MS技術(shù)只能確定某一物質(zhì)的相對含量，不能確定其真正的含量，因此今后有必要繼續(xù)對造成綠山楂種子休眠的內(nèi)源抑制物的含量進(jìn)行測定。另外，這些內(nèi)源抑制物的中濃度還需要通過購買標(biāo)樣的方式進(jìn)行確定，以最終確定哪些內(nèi)源抑制物是造成綠山楂種子生理休眠的重要原因。本次在各相中或多或少都存在一些未知物質(zhì)，可能是計(jì)算機(jī)圖庫未比對出這些物質(zhì)，也可能是幾種物質(zhì)的混合物沒有完全分離，具體原因還有待進(jìn)一步研究。根據(jù)生物活性測定(表1)，水相對白菜籽發(fā)芽也具有一定的抑制作用，但由于儀器的限制，水相中具體的抑制物質(zhì)也未能確定出來。